Fluoreszenzmikroskopie Nanometerlineale für Superauflösungs-Mikroskopie

Neue Methoden können heute die Auflösung von Fluoreszenzmikroskopen deutlich verbessern. Um diese Methoden miteinander zu vergleichen und die Funktionsfähigkeit eines Mikroskops zu überprüfen, wurden nun aus DNA bestehende Nanometerlineale entwickelt.

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Seit ihrer Erfindung im 16. Jahrhundert hat die Lichtmikroskopie mit der fundamentalen Einschränkung durch das später so genannte Abbe’sche Beugungslimit zu kämpfen. Das Beugungslimit besagt, dass die zu erzielende Auflösung niemals besser sein kann als ein bestimmter Wert, der grob der halben Wellenlänge des verwendeten Lichtes entspricht. Dadurch sind zu kleine Strukturen wie verschiedene Zellorganellen und Proteinkomplexe in dieser Mikroskopie prinzipiell nicht zu erkennen. Erst in den letzten Jahren ist es verschiedenen Forschergruppen gelungen, Wege zu finden, die diese Limitierung umgehen können [1]. Zahlreiche mittlerweile entwickelte Superauflösungsmethoden unterscheiden sich nicht nur in ihrer Funktionsweise, sondern auch in dem Grad der Auflösung, der mit der jeweiligen Methode erreichbar ist. Außerdem unterscheiden sich die Bedingungen, unter denen optimale Auflösung erreicht wird. Um das näher untersuchen zu können, wird eine wohldefinierte Probe benötigt, mit der das jeweils erzielte Auflösungsvermögen quantitativ vermessen werden kann. Bisher wurden dafür zumeist Aktinfilamente oder Mikrotubuli (netzartige Strukturen innerhalb einer Zelle) verwendet.

Nachteil: Kein reproduzierbares Messen möglich

Auch wenn diese Struktur sich hervorragend eignet, um Superauflösung qualitativ zu demonstrieren, weist sie dennoch den Nachteil auf, dass die Anordnung der Farbstoffmoleküle bei jeder Messung eine vollkommen andere ist und somit ein reproduzierbares Vermessen nicht erfolgen kann.

Den entscheidenden Ansatz zur Erzeugung reproduzierbarer und standardisierter Proben stellt die so genannte DNA-Origami-Technik dar [3]. Diese Technik verwendet ein langes DNA-Molekül, das mithilfe vieler kurzer DNA-Stücke, die zu unterschiedlichen Bereichen des langen DNA-Moleküls komplementäre Sequenz aufweisen, in eine gewünschte Struktur gefaltet wird. Die Form dieser Struktur lässt sich dabei durch die Wahl der Sequenzen der DNA-Stränge frei programmieren.

In Abbildung 2 ist schematisch die Faltung zu einem Rechteck dargestellt. Praktisch wird der lange DNA-Strang mit einem Überschuss an kurzen DNA-Stücken in einem Puffer auf ca. 80 °C erhitzt und dabei denaturiert. Die Faltung erfolgt dann beim langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur. Zudem können an DNA-Origamis einfach weitere Moleküle, z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, angebracht werden, indem farbstoffmarkierte DNA-Stücke eingesetzt werden. Das Anbinden kann mit einer Präzision im Bereich von einem Nanometer erfolgen.

Dies wird dadurch erreicht, dass die DNA-Origami-Struktur sehr starr sein kann und durch die vorherige Programmierung bekannt ist, welches DNA-Stück sich an welcher Position im DNA-Origami befindet. Ein DNA-Origami kann somit als molekulare Lochrasterplatte verwendet werden, auf der die Anzahl der Farbstoffmoleküle, sowie deren Abstände nahezu beliebig gewählt werden kann. Hierauf basierend wurden nun Nanometerlineale für verschiedene Anwendungen hergestellt.

Das Spektrum reicht dabei von Linealen für beugungsbegrenzte Mikroskopie, die einen Farbstoffabstand von etwa 350 nm erfordert, über Lineale für Sted-Mikroskopie [1] (s. Abb. 1) und stochastische Lokalisierungsmikroskopie (Storm, dStorm, Palm [5], Blink-Mikroskopie [6], etc.), welche Abstände zwischen 20 nm und 100 nm benötigen, bis hinunter zu molekularen Skalen von 2-20 nm welche durch aufeinanderfolgendes Photobleichen (s. Abb. 3) oder Fret zugänglich sind.

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