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HPLC

Quality by Design in der HPLC

| Autor / Redakteur: Hans-Werner Bilke* und Stefan Moser** / Marc Platthaus

Trennoptimierung

Zur Optimierung wichtiger HPLC-Methodenparameter wie Gradientenzeit, Säulentemperatur, ternäre Eluentzusammensetzung oder pH des wässrigen Eluenten sind 12 x 3 = 36 Experimente notwendig. Die experimentellen Chromatogramme aller 36 Grundläufe liefern die Daten (Retentionszeiten und Peakflächen) für eine exakte Peakzuordnung mit dem Softwaretool „Peakmatch“ als Voraussetzung zur 3D-Modellierung der Einflussgrößen Gradientenzeit, Temperatur, ternäre Eluentzusammensetzung und pH in Abhängigkeit von der Auflösung des jeweiligen kritischen Peakpaares. Wenn nur drei HPLC-Parameter für die Trennung signifikant sind, bringt die Strategie der 3-Faktor-Optimierung mit der chromatographischen Modellierungssoftware Drylab 4 einen wesentlichen Fortschritt für das Aufspüren und Verifizieren des „globalen Optimums“ der Trennung. Aufgrund dieser Limitierung können mit den 3-Faktor-Modellen „tG-T-pH“ und „tG-T-tC“ die multidimensionale Kombinationen und Wechselwirkungen aller signifikanten HPLC-Parameter (in der Regel sind es weit mehr als drei Parameter) nicht gleichzeitig betrachtet werden, wie in der „Design-Space“-Definition [5] gefordert.

Tatsache ist aber, dass das wahre Optimum, d.h. das „globale Optimum“, nur gefunden werden kann, wenn alle signifikanten Faktoren einer HPLC-Trennung gleichzeitig variiert werden können. Um global zu optimieren, wäre z.B. ein x-Faktor-Modell zur simultanen Variierung der HPLC-Parameter notwendig. Man muss sich hierfür ein multidimensionales Gebilde vorstellen, in dem man genau die Einstellung an Faktoren finden muss, die zur Trennung aller Peaks führt [6].

Statistische Versuchsplanung

Mit statistischer Versuchsplanung [7] zu arbeiten, bedeutet bereits vor Beginn einer Versuchsreihe klare Ziele zu definieren und systematisch vorzugehen. Mit wenigen Versuchen kann der Wirkzusammenhang zwischen sieben Einflussgrößen und zwei Zielgrößen der HPLC-Methode ermittelt und gut durch ein empirisches Prozessmodell (s. Abb. 1) beschrieben werden. Da die Schätzung von Wechselwirkungen zwischen den Einflussgrößen in der Optimierung von HPLC-Trennungen sehr wichtig ist, wird hier ein Rechtschaffner-Versuchsplan für „Response Surface Modeling“ [9] zur Lösung der Aufgabenstellung einer multifaktoriellen Trennoptimierung verwendet. Dieser Versuchsplan-Typ erlaubt die Untersuchung aller linearen Haupteffekte, deren eventuelle Nichtlinearität in quadratischer Näherung sowie aller Wechselwirkungen ohne Vermengungen. Alle SVP-Experimente wurden mit dem Drylab tG-T-tC-Modell simuliert. Zu beachten sind die „negativen“ Auflösungswerte der Peakpaare [10]. Diese Peakpaare weisen in Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen eine Peakumkehr auf.

Statistische Absicherung

Grundlage der Monte-Carlo-Simulation (MCS) ist es, einen zuverlässigen, robusten Arbeitspunkt innerhalb des Faktorraums zu finden, welcher auch die Unschärfe des Models berücksichtigt. Dies geschieht mittels Simplex-Verfahren indem die Einflussgrößen der Methode solange variiert werden, bis eine maximale Annäherung an die Zielgrößen erreicht ist. Um zu verhindern, dass die Optimierung im lokalen Optimum einzelner Zielgrößen endet, werden immer von mehreren Startpunkten Optimierungsschleifen simultan und konkurrierend gestartet. Ist die Faktoreinstellung eines globalen Optimums gefunden, ist es notwendig die natürlichen Einstellgenauigkeiten der Methode zu untersuchen. Dies bedeutet, dass untersucht wird, ob die Methode noch robust ist, wenn alle Faktoren unabhängig voneinander innerhalb ihrer Ungenauigkeit variieren.

Eine standardisierte Methode diese Unschärfe zu untersuchen, stellt die Monte-Carlo-Simulation dar. Für diese Simulation werden die zukünftig anzunehmenden Toleranzen der Faktoren aus den Gerätespezifikationen entnommen beziehungsweise abgeschätzt und anschließend über eine Vielzahl unabhängiger Variationen innerhalb der MCS auf ihren Einfluss hin ausgewertet.

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