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LABORAUTOMATION SPECIAL

Roboter sucht nach Mikroben

| Autor/ Redakteur: O. LANGE*, M. ERHARD** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Roboter Miob beschleunigt und verbessert die Arbeit mit Agar -Wachstumsmedien.

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Abbildung 1
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( Archiv: Vogel Business Media )

Die Auswahl und Übertragung von zum Teil pathogenen Mikro-organismen von Agar-Wachstumsmedien auf das MAL-DI-TOF Target ist eine zeitinten-sive und nicht selten gefährliche manuelle Tätigkeit. Der Roboter „Mirob“ beschleunigt diesen Vorgang auf etwa 100 Proben pro Stunde, reduziert den menschlichen Kontakt zu den Organismen und sichert zusätz-lich den Work flow mit flexibler Bilderkennungs- und Dokumentationssoftware.Die Vorbereitung mikrobieller Proben, welche direkt von einer Petrischale genommen werden, ist mit handelsüblicher Automatisierungstechnologie kaum befriedigend gelöst. Handarbeit ist der Laboralltag. Dabei sind viele Mikroorganismen, insbesondere die klinischer Herkunft, gefährlich und verlangen viel Konzentration und Dokumentationsarbeit, schließlich geht es um Menschenleben.

Die schnelle Analytik ist der Grundstein einer Automatisierung – die Probenvorbereitung wird zum produktionstechnischen Flaschenhals, um das Geschwindigkeitspotenzial der Messtechnik auszuschöpfen. Gleichzeitig erhöht die Automatisierung die Arbeitsplatzsicherheit, da ein Roboter die Probenübertragung vornimmt. Mirob (Mikroorganismen-Transfer-Roboter) entnimmt die Proben direkt aus der Petrischale und bereitet die Artenidentifizierung vor. Auf Wunsch wird gleichzeitig eine Flüssigkultur als Rückstellprobe in einer Mikrotiterschale angeimpft. Die Auswahl der Kolonien erfolgt reproduzierbar durch eine Bildverarbeitung, die Größe, Form, Farbe und Wuchstyp auch auf verschiedenfarbigen Wachstumsmedien unterscheidet. Jeder Schritt wird dokumentiert, und mittels Barcode sind die Proben vollständig zurückzuverfolgen. Die Bilder und die Entnahmestellen bleiben in der Datenbank ebenso gespeichert wie die eingestellten Auswahlkriterien der Bildverarbeitungssoftware. Der Auswahlprozess jeder einzelnen Probe ist reproduzierbar, da er auf quantifizierbaren Kriterien der Bildverarbeitung basiert. Je nach Einstellung kann die Auswahl der zu untersuchenden Kolonien vollautomatisch oder halbautomatisch per Mausklick vorgenommen werden. Die Suche nach neuen Mikroorganismen, neuen Wirkstoffen und die schnelle klinische und lebensmitteltechnische Analyse direkt aus der Petrischale sind somit vollständig automatisiert.Ablauf Die Petrischalen werden über ein Förderband in den Roboter geschleust. Ein Vakuumsauger nimmt den Deckel ab, der Greifarm hebt die Petrischalen vom Band und setzt sie auf einen Positioniertisch ab. Der Tisch positioniert die Schalen hochgenau, so dass auch Pin-Point-Kolonien von 0,5 mm Durchmesser sicher erkannt, ausgemessen und entnommen werden können. Das Zellmaterial wird auf das MALDI-Target übertragen oder suspendiert. Anschließend impft derselbe Entnahmestab das in der Mikrotiterplatte vorbereitete Kulturmedium an. Der Probenentnahmestab ist als Disposable ausgeführt und wird automatisch vor jeder neuen Probe gewechselt. Nach Aufsetzen des Deckels werden die Petrischalen wieder über das Förderband aus der Roboterstation transportiert. Die Materialflusskontrolle ist für das Massenscreening essentiell, um eine eindeutige Zuordnung der Ergebnisse zur Probe zu gewährleisten. Die eingesetzten Barcodes werden, um die Bildverarbeitung nicht zu beeinträchtigen, seitlich an die untere Petrischale angebracht. Da die Rundung kleiner Schalen das Ablesen durch Barcodescanner erschwert, wurde eine kamerabasierte Lösung integriert. Ein Rundumspiegel macht den Barcode für die Bildverarbeitungskamera sichtbar, eine handelsübliche Software deckt ein breites Spektrum der üblichen Barcodes ab. Der Roboter erzeugt für jede Probe einen zugehörigen Datenbankeintrag. Somit konnte auf einen zusätzlichen Barcode-Reader verzichtet werden. Die Kriterien für die Bilderkennung werden durch den Benutzer eingestellt. Danach kategorisiert der Roboter die Kolonien aufgrund ihrer Größe, Farbe, Rundheit und Oberflächenstruktur. Das Bilderkennungsprogramm schlägt dem Anwender alle ermittelten Kategorien vor. Der Benutzer hat die Möglichkeit, die Entnahmepositionen zu akzeptieren, neue Positionen frei zu wählen oder das System vollautomatisch arbeiten zu lassen. Auf dieser Grundlage erfolgt die Probennahme. Es ist möglich, alle oder nur eine Probe/Kolonie zu entnehmen. Um eine Reinzucht zu gewährleisten, können unrunde Kolonien von der Probennahme ausgeschlossen werden. Ebenso existieren Parameter für minimale Größe und Sicherheitsabstand zwischen zwei Kolonien. So wird die Entnahme einer Mischprobe unwahrscheinlich. Bei der halbautomatischen Auswahl legt der Laborspezialist die zu pickenden Stellen am Bildschirm fest. Der Vorteil ist, dass dafür die physische Anwesenheit im Labor nicht notwendig ist, da dies über ein Netzwerk ebenso erledigt werden kann. Der Probenstab wird über der Kolonie positioniert (etwa 5 mm) und dann gelöst. Der Stab fällt das kurze Stück und wird wieder verklemmt. Der Kontakt ist auf diese Weise ohne zusätzliche Feinsensorik garantiert, und das Agar bleibt unberührt. Der Stift vibriert und kann vorher mit Wasser benetzt werden. Damit wird erreicht, dass auch von harten und/oder krustigen Kolonien ausreichend Zellmaterial aufgenommen wird. Das Ablegen folgt dem gleichen Muster. Auch hier kann die Ablagestelle vorher mit Wasser benetzt werden, so dass durch Vibration des Stabes eine Suspension erzeugt wird. Droht ein Überladen der Probenposition auf dem MALDI-Taget, kann der Benutzer eine Verdünnung durch mehrfaches Ablegen erzeugen. Zuletzt wird die Mikrotiterplatte beimpft. Der Probenstab wird ausgeworfen und ein neuer aus dem Vorratsbehälter automatisch von oben nachgeführt.ZusammenfassungMit der Entwicklung des neuen Mirob-Systems steht den Mikrobiologen ein vollautomatisiertes System zur schnellen Identifizierung der Bakterien und Pilze zur Verfügung. Der Gesamtprozess beinhaltet folgende Stufen: Im ersten Schritt analysiert und überträgt der Mirob die Mikroorganismen auf das MALDI-Target. Im zweiten Schritt erfolgt die MALDI-TOF-Messung, bei der für jeden Organismus ein charakteristisches Proteinmassenmuster erzeugt wird. Dieser phänotypische Abdruck wird im dritten Schritt anschießend mittels AnagnosTec Saramis (Spectral Archive And Microbial Identification System) gegen Referenzmuster abgeglichen und identifiziert. Mit dem neuen System können alle Mikroorganismen der Risikoklassen 1, 2 und 3 sicher und schnell bearbeitet werden. In der Regel erfolgt eine Identifizierung in zwei bis drei Minuten. Zusätzlich werden nach der IVD- und FDA-Richtlinie alle Prozesse dokumentiert. Das System eignet sich für den Einsatz in der human- und veterinärmedizinischen Routine sowie bei allen Untersuchungen größerer Stammzahlen.HintergrundSchnelle Identifizierung von Bakterien und PilzenEtablierte Analytik zur Identifizierung von Bakterien und Pilzen in der täglichen Laborroutine wird größtenteils manuell oder halbautomatisch (Auswertung) in einem Zeitraum von vier bis zwanzig Stunden durchgeführt. Derartige Identifi-zierungen können alternativ mit einem MALDI-TOF Massenspektrometer und der AnagnosTec SARAMIS- Applikation innerhalb weniger Minuten durchgeführt werden. Vergleicht man die „Fingerprint-Massenspektren“ des zu identifizierenden Mikroorganismus mit der SARAMIS-Datenbank, so lässt sich innerhalb weniger Sekunden der Genus der Organismen bestimmen. Durch die Entwicklung des Mirob (Mikroorganismen-Transfer-Roboter-Systems) zur schnellen und siche-ren Übertragung von Zellmaterial auf das MALDI-Taget wird diese Methode erst-mals von der Probennahme bis zur Über-gabe der Ergebnisse ans LIMS durchgän-gig automatisiert. Somit ist diese neue Methodenkombination nicht nur schneller als genetische, biochemische und serologi-sche Nachweismethoden, sondern durch ihre Rückverfolgbarkeit bis zum Aus-gangsmaterial auch IVD-Richtlinien-konform. LiteraturStackebrandt E., Päuker O. and Erhard M.: Identifying myxococci (Corallococcus) strains by Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI TOF) Mass Spectrometry and comparison with gene sequence phylogenies, Curr. Micro-biol. Volume 50, Number 2; Date: February 2005; Pages: 71 - 77 Schmidt, O. & Kallow, W.: Differentiation of indoor wood decay by fungi with MALDI-TOF mass spectrometry; 2005 Holzfor-schung, Vol. 59, pp. 374-377Dieckmann R, Graeber I, Kaesler I, Szewzyk U, von Dohren H.: Rapid screening and dereplication of bacterial isolates from ma-rine sponges of the Sula Ridge by Intact-Cell-MALDI-TOF mass spectrometry (ICM-MS); Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004 Dec 22Kroppenstedt RM, Mayilraj S, Wink JM, Kal-low W, Schumann P, Secondini C, Stacke-brandt E. (2005): Eight new species of the genus Micromonospora, Micromonospora citrea sp. nov., Micromonospora echinau-rantiaca sp. nov., Micromonospora echino-fusca sp. nov. Micromonospora fulviviridis sp. nov., Micromonospora inyonensis sp. nov., Micromonospora peucetia sp. nov., Micromonospora sagamiensis sp. nov., and Micromonospora viridifaciens sp. nov.; Syst Appl Microbiol. 28(4): 328-39Die AutorenDr. Oliver Lange: Bis 1998 Studium Biologie (Ökologie, Populationsgenetik, Mikrobiologie, Biochemie und Informatik) an den Universitäten in Mainz und Wales; 2002 Promotion in Mainz zum Einfluss von Umweltvariationen auf die genetische Vielfalt von Populationen; seit 2002 Wis-senschaftlicher Mitarbeiter in der Abtei-lung Robotersysteme mit dem Schwer-punkt Life-Science und Laborautomatisie-rung im Fraunhofer IFFDr. Marcel Erhard: Bis 1996 Studium der Chemie (Schwerpunkte physikalische Chemie und Biochemie) an der Techni-schen Universität Berlin; 1996-1999 Pro-motion an der TUBerlin zur MALDI-TOF MS Analyse und Biosynthese von Natur-stoffen; seit 1999 Geschäftsführer A-nagnosTec * Fraunhofer Institut für Fabrikbetrieb und -automatisierung, Magdeburg** AnagnosTec GmbH, Im Biotechnologiepark, Luckenwalde

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