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Chromatographische Trennung Säulenvielfalt der Bio-LC

Redakteur: Christian Lüttmann

Die Analytik von Antikörpern, Hormonen und anderen Biomolekülen ist herausfordernd, sind die Moleküle doch sehr groß. Mit den passenden Trennsäulen bringt die HPLC trotzdem gute Ergebnisse.

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Abb.1: YMC-Triart-Bio-C18- und Bio-C4-Säulen sind ausgelegt für unterschiedliche Substanzen aus dem Bereich der BioLC: Peptide/Proteine, Antikörper und Oligonukleotide.
Abb.1: YMC-Triart-Bio-C18- und Bio-C4-Säulen sind ausgelegt für unterschiedliche Substanzen aus dem Bereich der BioLC: Peptide/Proteine, Antikörper und Oligonukleotide.
(Bild: YMC)

Die Analytik von Biomolekülen ist besonders im klinischen Forschungsalltag relevant. So kann etwa die Analyse des Proteoms, also der Gesamtheit aller Proteine, Aussagen über den Gesundheitszustand eines Patienten ermöglichen. Auch Oberflächenproteine von Zellen oder Viren sind wichtige Analyten in biomedizinischen La­boren. Als jüngstes Beispiel sei hier das Spike-Protein des neuartigen Coronavirus genannt, dessen Erforschung dabei hilft, wirksame Impfstoffe zu entwickeln. Die Schwierigkeit bei der Analyse von biologischen Proben ist, dass eine große Vielfalt an verschiedenen Molekülen vorliegt. Die relevanten Spezies müssen also zunächst von den anderen Bestandteilen getrennt werden. Hierfür bietet sich in der Regel eine chromatographische Trennung in Form einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) an.

Der Faktor Porengröße

Abb.2: Effekt der Porengröße auf die Trennung von Peptiden und Proteinen. Die Säulen mit 300 Å Poren weisen auch bei großen Analyten noch eine vergleichsweise schmale Halbwertsbreite der Peaks auf.<br>γ-Endorphin (MW 1859), Insulin (MW 5733), Lysozyme (MW 14.000), β-Lactoglobulin (MW 18.363), α-Chymotrypsinogen A (MW 25.656), BSA (MW 66,000), Conalbumin (MW 76.000)
Abb.2: Effekt der Porengröße auf die Trennung von Peptiden und Proteinen. Die Säulen mit 300 Å Poren weisen auch bei großen Analyten noch eine vergleichsweise schmale Halbwertsbreite der Peaks auf.<br>γ-Endorphin (MW 1859), Insulin (MW 5733), Lysozyme (MW 14.000), β-Lactoglobulin (MW 18.363), α-Chymotrypsinogen A (MW 25.656), BSA (MW 66,000), Conalbumin (MW 76.000)
(Bild: YMC)

Neue HPLC-Phasen für Biomoleküle wie Peptide, Proteine, Antikörper oder auch Oligonukleotide müssen dabei eine Vielzahl herausfordernder Kriterien erfüllen. Diese umfassen vor allem hohe Temperaturbeständigkeit, hohe pH-Stabilität, eine hohe Auflösung und damit auch eine entsprechende MS-Kompatibilität. Eigenschaften wie eine hohe Robustheit der Phasen sowie im Speziellen eine exzellente Lot-zu-Lot-Reproduzierbarkeit für den Einsatz in der Qualitätskontrolle sind ebenfalls wichtig.

Entscheidend für die chromatographische Trennung von Biomolekülen ist eine ausreichende Porengröße des Trennmaterials: 300 Å erlauben auch größeren Analyten wie Antikörpern und großen Proteinen, dass diese in die Poren eindringen und mit der „inneren Oberfläche“ wechselwirken. Im direkten Vergleich von Säulenpackungen mit 300 und 120 Å Porendurchmesser wird der Unterschied in der Trennqualität deutlich: Ab einem Molekulargewicht von etwa 10.000 Da erhält man bei den kleineren Poren in der Regel deutlich verbreiterte Peaks mit doppelter bis dreifacher Halbwertsbreite. Die 300-Å-Poren erlauben hingegen auch bei höheren Molekulargewichten noch schmale Peaks (s. Abb. 2).

Zentrale Säuleneigenschaften

Für die Trennung der Analyten sorgt aber nicht die Porengrößenverteilung, wie es bei der Größenausschlusschromatographie der Fall ist, sondern die Affinität des Packungsmaterials zu den Probenmolekülen. Hier ist die Selektivität der Säule entscheidend für ein gutes Trenn­ergebnis. Als Beispiel seien die C18-Säulen und die C4-Säulen „YMC-Triart Bio“ genannt. Sie bieten spezifische Selektivität für die Peptid- und Proteinanalytik sowie für die Analyse von Antikörpern und Oligonukleotiden. Die C18-Säulen sind für die Trennung von Proteinen und Peptiden mit mittlerem Molekülgewicht ausgelegt, wie für das Wachstumshormon Somatropin mit 22 kDa, sowie für Oligonukleotide. Wegen der reduzierten Hydrophobizität gegenüber konventionellen C18-Phasen, ist es mit YMC-Triart-Bio-Säulen möglich, kürzere Analysenzeiten für stark retardierende Substanzen zu realisieren.

Wo der Fokus auf der Analyse intakter Antikörper liegt, sind Säulen mit kürzeren C4-Liganden empfehlenswert. Dank hoher Temperaturstabilität lassen sich intakte Antikörper nahezu ohne Einschränkungen analysieren. Des Weiteren sind die Säulen aufgrund ihrer niedrigen Hydrophobizität besonders für die Analytik von großen, sehr hydrophoben Proteinen oder Peptiden geeignet, z.B. Amyloid-β-Peptiden.

Methodenentwicklung in F&E

Gerade für Forschung und Entwicklung (F&E) sind hohe Temperatur- und pH-Stabilität der Säulen wichtig. Dies erleichtert die Methodenentwicklung, da ein breites Fenster an Parametern genutzt werden kann, um eine neue Trennaufgabe zu optimieren. Mit den auf Bioanalytik ausgelegten YMC-Triart-Säulen sind Trennungen bei bis zu 90 °C und in einem pH-Fenster von 1-10 möglich (für C18-Säulen bis pH 12).

Präparative Anwendungen

Neben den „Standard-Säulen“ gibt es auch diverse Ausführungen für speziellere Trennaufgaben. So bieten etwa Formate in Micro-LC- und Nano-LC-Dimensionen eine besonders hohe Sensitivität und erlauben die Analyse kleinster Probenmengen.

Für (semi)präparative Ansätze muss hingegen ein höherer Probendurchsatz erreicht werden, was entsprechend höhere Flüsse erfordert und damit höhere Drücke verursacht. Dies beansprucht die Packung erheblich und führt irgendwann dazu, dass das Packungsmaterial weiter verdichtet wird und so kleine Hohlräume entstehen. Die Folge: Nach wenigen hundert Durchläufen kann die Trennqualität abnehmen, die Peaks werden breiter. Bei präparativen Anwendungen ist es daher wichtig, besonders dicht gepackte, druckstabile Säulen einzusetzen. Durch eine 10% höhere Packungsdichte als bei herkömmlichen Säulen, wie sie bei der YMC-Actus-Säulenhardware verwendet wird, kann beispielsweise die Trennleistung über 800 bis 1000 Zyklen hinaus erhalten bleiben.

* Kontakt: YMC Europe, 46539 Dinslaken

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