Strukturaufklärung von Proteinkomplexen

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Technische Universität München

Helmholtz Zentrum München - Dt. Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)

Strukturbestimmung von Proteinen

Am Helmholtz-Zentrum München wurden nun mehrere bekannte NMR-spektroskopische Methoden zu einer effizienten Strategie für die Bestimmung der Raumstruktur von Biomolekülen in Lösung kombiniert [5]. Im neuen Verfahren werden leicht und schnell erhältliche strukturelle Informationen aus NMR-Daten verwendet, um die Gesamtstruktur wie in einem Puzzle zusammenzusetzen. Im ersten Schritt werden existierende Strukturinformationen der Untereinheiten eines Proteinkomplexes oder eines Proteins, das aus mehreren Untereinheiten (Domänen) besteht, gesammelt. Dabei hilft es, dass viele Strukturen einzelner Domänen schon mittels NMR-Spektroskopie oder Kristallstrukturanalyse bestimmt wurden und in der Protein Data Bank (PDB) verfügbar sind. In den nächsten Schritten wird bestimmt, wie diese Untereinheiten räumlich zueinander angeordnet sind. Hierzu werden zwei verschiedene Arten von Informationen ausgenutzt, die durch NMR-Experimente gewonnen werden können. Zum einen geben so genannte dipolare Restkopplungen (residual dipolar couplings; RDCs) Information über die relative Orientierung der einzelnen Untereinheiten des Komplexes. Zum anderen werden an mehreren Stellen des Proteins so genannte Spinlabels durch Kopplung an einen Cysteinrest eingeführt. Das Spinlabel (s. Abb. 2) besitzt ein ungepaartes Elektron und bewirkt dadurch so genannte paramagnetische Relaxationsverstärkungen (paramagnetic relaxation enhancements; PREs). Diese sind abstandabhängig und erlauben es, Abstände bis zu 20 Å zwischen den Untereinheiten zu messen und dadurch die dreidimensionale Struktur des Proteinkomplexes festzulegen (s. Abb. 3).

Diese NMR-basierten Experimente können zusätzlich durch Daten aus der Röntgen- oder Neutronenkleinwinkelstreuung (small angle scattering; SAS) ergänzt werden. Solche Kleinwinkelstreuverfahren können niedrigaufgelöste Information über die Molekülgestalt in Lösung geben. SAS- und NMR-Daten können gemeinsam in einer Strukturrechnung verwendet werden und liefern komplementäre Strukturinformation zur Untersuchung von Proteinkomplexen in Lösung (s. Abb. 4).

Struktur eines Spleißfaktors

Das Verfahren wurde am menschlichen Spleißfaktor U2AF65 durchgeführt, dessen RNA-bindende Region aus zwei Untereinheiten besteht (RRM1-RRM2). Der Prozess des Spleißens ist ein wichtiger Schritt der RNA-Prozessierung im Zellkern von Eukaryoten, bei dem nicht-kodierende Introns aus der prä-mRNA durch das Spliceosome herausgeschnitten werden. Spleißfaktoren sind bei der Regulation der Genexpression entscheidend und tragen unter anderem dazu bei, dass aus einem Gen unterschiedliche Proteine gebildet werden können. Die genaue Erkennung und Definition der Schnittstellen ist von immenser biologischer und medizinischer Relevanz: etwa 15 Prozent aller genetischen Erkrankungen werden mit Veränderungen der Schnittstellen in Verbindung gebracht und zahlreiche Krebsarten und Erbkrankheiten sind Abnormalitäten des alternativen Spleißen zuzuschreiben. Die RRM1-RRM2-Tandem-Domänen des Spleißfaktors U2AF65 sind für die spezifische Erkennung und Definition der Schnittstellen in der prä-mRNA verantwortlich. Mit dem oben beschriebenen Verfahren konnte die Struktur des Komplexes aus U2AF65 RRM1-RRM2 und einer Intron RNASequenz bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass die Struktur in Lösung deutlich von der durch Röntgenstrukturanalyse bestimmten Struktur abweicht. Dies ist vermutlich auf die Beeinflussung der Dynamik im Kristall und der für die Kristallisation benötigten Deletion des 20 Aminosäuren langen Linkers zwischen den beiden Domänen zurückzuführen. Die Flexibilität des Linkers und die damit verbundene Dynamik der Raumstruktur sind für die Funktion des Proteins aber von hoher Bedeutung, und konnten hier nur durch Strukturbestimmung in Lösung mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert werden.

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