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STED-Mikroskopie und SIMS Zellbestandteile im Nanometer-Bereich analysieren

| Autor / Redakteur: Angela Vogts*, Sinem Saka** und Silvio Rizzoli** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Forscher der Georg-August-Universität Göttingen und des Leibniz-Instituts für Ostseeforschung haben ihr Wissen in räumlich hoch aufgelöster Analytik kombiniert. Optische Analysen per STED-Mikroskopie und isotopische Messresultate per Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS) liefern Einblicke in den Stoffumsatz der einzelnen Zellorganellen.

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Abb. 2: Vergleich von klassischer Mikroskopie (konfokal) und STED-Mikroskopie
Abb. 2: Vergleich von klassischer Mikroskopie (konfokal) und STED-Mikroskopie
(Bild: Leibniz-Institut für Ostseeforschung/Universitätsmedizin Göttingen)

Wenn Forscher eine Zelle betrachten wollen, nutzen sie in der Regel ein Mikroskop. Aber wenn sie sich für kleinste Zellbestandteile interessieren, wie z.B. synaptische Vesikel, die Transportbehälter für Neurotransmitter in den Nervenzellen, dann erreicht die Standardmikroskopie ihre Grenze. Diese Grenze liegt, bedingt durch die Wellenlänge des Lichts, bei ca. 200 Nanometern. Synaptische Vesikel sind kleiner.

Blick in die Zelle – per STED-Mikroskopie

An der Georg-August-Universität in Göttingen werden daher die Vorgänge in Nervenzellen mit der so genannten STED-Mikroskopie untersucht. Diese Methode erlangte im vergangenen Jahr besondere Bekanntheit, da der Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung dieser Technik vergeben wurde. STED steht dabei für Stimulated Emission Depletion. Das Funktionsprinzip dieser Methode: Markersubstanzen werden in eine Zelle gebracht und mit Laserlicht einer bestimmten Wellenlänge stimuliert. Diese Anregung führt zur Emission von Licht, die aber von einem anderen ringförmigen Laserlicht zu einem großen Teil ausgelöscht wird (Depletion). Nur ein kleiner, zentraler Teil des von der Probe emittierten Lichts wird bis zum Detektor durchgelassen. Die Forscher schauen quasi wie durch eine Lochblende oder ein Schlüsselloch auf z.B. eine Zelle. Die Probe wird mit dieser Technik Punkt für Punkt analysiert und es ergibt sich ein Bild mit deutlich besserer Auflösung als bei herkömmlicher Mikroskopie. Durch Anwendung von an die Fragestellung angepassten Markersubstanzen kann die STED-Mikroskopie so z.B. aktive Zonen in einer Zelle identifizieren oder eben einzelne synaptische Vesikel sichtbar machen. Wie aktiv diese Zellbereiche sind, ob sie frisch gebildet wurden oder schon länger Teil der Zelle sind, vermag die STED-Mikroskopie aber nicht zu zeigen.

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Isotopische Analysen mit Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS)

Um die Aktivität von Zellen zu bestimmen werden Experimente mit stabilen Isotopen durchgeführt. So nutzen die Wissenschaftler z.B. 15N-Leucin, eine für höhere Organismen zum Leben notwendige Aminosäure, in der statt des natürlich häufig vorkommenden 14N das seltenere 15N gebunden ist. Eine Zelle erkennt keinen Unterschied und nutzt das 15N-Leucin wie das natürlich vorkommende. Um dieses 15N dann in den Zellen aufzuspüren, wird Sekundärionenmassenspektrometrie (SIMS) eingesetzt, in diesem Fall das NanoSIMS50L am Leibniz-Institut für Ostseeforschung in Warnemünde. Bei der SIMS werden Primärionen auf die Probe „geschossen“ dabei entstehen Sekundärionen, die durch das Sektorfeldmassenspektrometer entsprechend ihrer Masse getrennt werden. Bei den Sekundärionen handelt es sich in der Regel um mono- und diatomare Einheiten (C-, CN-). Dadurch wird es möglich, die Isotope eines Elements (z.B. 12C und 13C) einzeln zu detektieren und Verhältniswerte zu berechnen. Da zudem die Probe Pixel für Pixel gescannt werden kann, ergeben sich bei diesen Analysen ebenfalls Bildaufnahmen. Aufgrund der speziellen Ionenoptik reicht die laterale Auflösung in den Bereich der STED-Mikroskopie. Gearbeitet wird bei der Kombination der beiden Methoden mit in Harz eingebetteten Proben, von denen Dünnschnitte angefertigt werden. Die Wahl des richtigen Harzes mit passenden Eigenschaften für die STED-Mikrokopie (keine Fluoreszenz) und die SIMS (kein Stickstoffgehalt, hochvakuumfest) ist essenziell. Ebenso wie die Etablierung von exakter Dokumentation und Markierung der relevanten Bereiche mittels Laser. Nur so können die im STED gefundenen nanometergroßen aktiven Bereiche mit dem NanoSIMS, das mehrere 100 km entfernt an einem anderen Institut steht, analysiert werden.

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