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IMAGING & MIKROSKOPIE

EPO-Analytik Unsichtbares sichtbar gemacht

| Autor/ Redakteur: Igor Holländer*, Christian Reichel* Und Günter Gmeiner* / Gerd Kielburger

Sportereignisse wie Olympische Spiele, Tour de France oder Leichtathletik-Weltmeisterschaften bringen immer wieder das Thema Doping hoch. Bei ARC Seibersdorf research wird an der Entwicklung einer sensitiven Digitalkamera mit Auswertungssoftware für EPODoping gearbeitet. Beides war bei den Olympischen Spielen in Athen im Einsatz.

Abb.1: Auf einem typischen EPO- Bild sind die EPO- Isoformen als Banden sichtbar.
Abb.1: Auf einem typischen EPO- Bild sind die EPO- Isoformen als Banden sichtbar.
( Archiv: Vogel Business Media )

Sportereignisse wie Olympische Spiele, Tour de France oder Leichtathletik-Weltmeisterschaften bringen immer wieder das Thema Doping hoch. Bei ARC Seibersdorf research wird an der Entwicklung einer sensitiven Digitalkamera mit Auswertungssoftware für EPODoping gearbeitet. Beides war bei den Olympischen Spielen in Athen im Einsatz.

Die Olympischen Spiele in Athen im August dieses Jahres haben die Doping-Diskussion erneut angefacht. Vor allem durch die gründliche Arbeit der World Anti-Doping Agency (WADA), die höchste internationale Autorität in Sachen Dopingsünden, kamen viele Dopingfälle von Spitzensportlern ans Tageslicht. Die WADA sorgt dafür, dass die Regeln und Methoden der Dopingkontrolle für heute mehr als 150 Substanzen weltweit standardisiert und harmonisiert werden. So kann die Dopinganalytik auf die neuesten verbotenen Dopingmittel rasch reagieren. Dies verlangt einerseits viel Know-how im Bereich der chemischen Analytik, andererseits aber auch interdisziplinäre Kooperation mit Experten in anderen Bereichen, wie etwa der Bildverarbeitung oder Softwareentwicklung.

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Erythropoietin - ein heißes Thema in der DopinganalytikErythropoetin (kurz EPO) ist ein körpereigenes Glykoprotein-Hormon, bestehend aus 165 Aminosäuren und vier Zuckerseitenketten. Es wird primär in der Niere gebildet und ist hauptverantwortlich für die Aufrechterhaltung einer konstanten Konzentration an Erythrozyten im Blut. Wird durch Sauerstoffmangel im Gewebe EPO ausgeschüttet, gelangt dieses über die Blutbahn ins Knochenmark, wo es an Rezeptoren der Erythrozytenvorläuferzellen (Stammzellen) bindet und die Bildung von roten Blutkörperchen, den Erytrozythen, anregt. Eine höhere Anzahl von Erythrozyten führt bei gleichem Volumenstrom des Blutes zu einem intensivierten Sauerstofftransport und dadurch zu besserer Ausdauerleistung. EPO wurde um 1970 erstmals aus Humanharn isoliert. Sein Name leitet sich vom Begriff der Erythropoese ab, mit dem die Bildung von roten Blutkörperchen bezeichnet wird.

1985 wurde EPO gentechnisch synthetisiert. Seitdem wird rekombinantes EPO (rhEPO) als Medikament vor allem bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz eingesetzt. Bis heute ist es das meistverkaufte rekombinante Arzneimittel, und wird insbesondere bei der Behandlung anämischer Zustände als Folge von Nierenerkrankungen, Chemotherapie, Knochenmarkstransplantationen oder in der HIV-Therapie eingesetzt. Kurz nachdem das Medikament 1987 auf dem Europäischen Markt kam gab es Indizien, dass es von Ausdauersportlern als Dopingmittel missbraucht wurde.

Was früher bei Athleten durch das Höhentraining erreicht wurde, konnte mit der Einführung von rhEPO als Medikament durch eine einfache Injektionsbehandlung erreicht werden: Eine von den Sportlern erhoffte Leistungssteigerung durch die vermehrte Bildung von Erythrozyten im Blut. Erhöhte Erythrozytenzahl verschafft insbesondere Ausdauersportlern zu Vorteilen im Wettkampf. Ein Überschuss an EPO hat allerdings gravierende Nebenwirkungen: Hoher Blutdruck, Thrombosenbildung und sogar Kollaps. In den schlimmsten Fällen kommt es zum Tod der Athleten. Schon 1990 reagierte die WADA und setzte EPO auf die Liste der verbotenen Substanzen. Das in Frankreich entwickelte Analyse-Verfahren für den Nachweis des Dopings mit rekombinantem EPO im Urin des Athleten soll nun international standardisiert werden. Dabei werden die Ladungsunterschiede zwischen endogenem - also vom Organismus selbst hergestelltem - und rekombinantem EPO durch elektrophoretische Trennung und Chemilunineszenzdetektion auf Membranen „sichtbar“ gemacht (siehe Kasten Erythropoetin-Analytik).

epoCAM - Das superempfindliche Auge

Die Lichtintensitäten, die bei Chemilumineszenzreaktionen üblicherweise erzielt werden, liegen häufig unter den vom menschlichen Auge wahrnehmbaren Helligkeiten. Das Auge muss sich daher einige Minuten an die Lichtverhältnisse in der Dunkelkammer anpassen, um zumindest die stärksten Banden auf der Membran registrieren zu können. Um solche Helligkeiten für weitere Analysen registrieren zu können, müssen spezifische Technologien eingesetzt werden.

Die Standardmethode basiert auf direkter Fotoregistrierung mittels Röntgenfilm. Die Empfindlichkeit des Filmmaterials ist bei längeren Belichtungszeiten genügend hoch. Probleme gibt es allerdings (abgesehen von der Notwendigkeit in der Dunkelkammer arbeiten zu müssen) mit dem dynamischen Bereich der Aufnahme. Besonders bei der chemilumineszenten Markierung sind die Helligkeitsunterschiede von wichtigen Bildmerkmalen extrem hoch. Der Röntgenfilm wird von den am intensivsten strahlenden Stellen der Vorlage rascher saturiert als von Stellen mit niedriger. Deswegen sollten digitale Akquisitionssysteme bevorzugt Verwendung finden, da deren CCD-Sensoren einen erhöhten linearen dynamischen Bereich bei vergleichbarer Empfindlichkeit garantieren (typischer Wert > 70dB).

Die epoCAM schließt die Lücke zwischen der Zeit- und Handling-aufwändigen Filmmethode und den hochpreisigen digitalen Mehrzweckaufnahmesystemen. Die Innovation beginnt bei der Auswahl des CCD-Chips. In der epoCAM wird ein CCD-Sensor verwendet, dessen Empfindlichkeit für Chemilumineszenzsignale optimiert ist.

Grundsätzlich ist die Sensitivität der CCD-Sensorchips durch mehrere Parameter beeinflusst: Der wichtigste ist die sog. Quantumeffizienz. Diese Zahl (in Prozent angegeben) repräsentiert die relative Anzahl von Photonen, die im Chip in effektive Elektronen (d.h. in Strom und folglich zu Signal) umgewandelt wird. Die Spektralempfindlichkeit des Sensors in der epoCAM wurde so gewählt, dass sie mit der Spektralcharakteristik typischer Chemilumineszenzsubstrate (Absorptionsmaximum zwischen 450 bis 500 nm) prinzipiell übereinstimmt, d.h. die Quantumeffizienz ist gerade bei diesen Wellenlängen optimal (55 Prozent bei 450 nm).

Bei den in der Chemilumineszenzdetektion häufig erforderlichen langen Belichtungszeiten ist gleichzeitig das Verhältnis von Messsignal zu Rauschen - also vor allem der sog. Dunkelstrom - von Bedeutung. Der Dunkelstrom (dark current) bezeichnet die spontane Bildung von Ladungen im CCD-Chip aufgrund von Wärmeentwicklung. Je länger die Exposition und je höher die Chiptemperatur, desto höher ist auch der Rauschanteil, und desto geringer die relative Empfindlichkeit. Bei vielen CCD-Chips ist dieser Faktor so dominant, dass ihre Funktionsfähigkeit erst durch Kühlung auf bis zu -30°C gewährleistet ist.

Der Dunkelstromwert der epoCAM ist schon bei Raumtemperatur um ein Vielfaches niedriger als der vergleichbarer CCD- Sensoren bei -25°C. Es wird deshalb nur ein einfacher (und daher preiswerter) Kühlungsmechanismus benötigt. Die Kamera ist weniger gegen Änderungen der Raumtemperatur empfindlich und schneller einsatzbereit. Die geometrische Auflösung der epoCAM beträgt 1392 x 1040 Pixel. Typische Belichtungszeiten für die EPO-Bilder liegen im Bereich von 2 bis 20 Minuten.

Sobald das Chemilumineszenzbild von der Kamera digitalisiert und an den PC übermittelt wurde, kommt die Analysesoftware GASepo zum Einsatz. Die Hauptaufgabe der Analyse ist es, endogenes und rekombinantes EPO aufgrund der Position und Intensität ihrer Isoformen voneinander zu unterscheiden. Unter dem Begriff der „Isoformen“ werden im Fall von Erythropoietin geringfügige und organismusspezifische Variabilitäten in der Kohlenhydrastruktur dieses Glykoproteins verstanden. Sie führen dazu, dass das Protein in unterschiedlichen Ladungszuständen vorliegen kann. Da die jeweilige Nettoladung dieser Isoformen vom pH-Wert abhängig ist, ist deren Trennung möglich. Die praktische Analyse der EPO-Bilder besteht aus mehreren Phasen. Jede Phase wird in der Software als ein Bedienungselement („Knopf“) dargestellt. Die Reihenfolge der Verarbeitungsschritte ergibt sich logisch aus der Position der Knöpfe. Nach jeder Eingabe wird die Konsistenz der Parametereinstellungen überprüft. Ein „undo“-Mechanismus ermöglicht es, beliebig viele Eingaben rückgängig zu machen. Nach dem Einlesen des digitalisierten Bildes werden zuerst aus dem Gesamtbild die für die Analyse wichtigen Region (Region of Interest) interaktiv ausgewählt.

Bandensegmentierung - das Herz der Bildverarbeitung

Bei der elektrophoretischen Trennung der EPO-Isoformen mit Hilfe der Methode der isoelektrischen Fokussierung (IEF) kommt es gelegentlich durch probenbedingte Inhomogenitäten im pH-Gradienten zu Störungen im elektrophoretischen Lauf der Proben (sog. „Laneverzerrungen“). Die richtige Identifikation der einzelnen Isoformen der Probe und deren Zuordnung zu den entsprechenden Isoformen im Standard wird dadurch erschwert. Zur Korrektur bietet sich eine Ausrichtung der Lanes anhand des probeninternen pH-Gradienten an. Seine Kalibrierung erfolgt mithilfe eines Indikatorfarbstoffes, der die Trennung der EPO-Isoformen nicht beeinflusst.

Aufgrund seiner Ladungseigenschaften ist Methylrot (2-(4'-Dimethylamino-phenylazo)benzoesäure) dafür besonders geeignet. Methylrot besitzt bei einem pH-Wert von 3,8 eine Nettoladung von Null und wandert daher bei Erreichen dieses Ladungszustandes nicht mehr in dem im Elektrophoresegel aufgebauten pH-Gradienten (Methode der sogenannten „isoelektrischen Fokussierung“, IEF). Da Methylrot der Elektrolytlösung zugesetzt wird und bei pH 3,8 rot gefärbt ist, bildet der Indikatorfarbstoff im Elektrophoresegel eine rot gefärbte Linie aus, die sogenannte „iso-pH Linie“. Eine Digitalaufnahme dieser iso-pH-Linie bildet das pH-Referenzbild, anhand dessen die EPO-Isoformen kalibriert werden.

Die GASepo-Software bietet dem Benutzer die Möglichkeit, das EPO-Bild mit einem pH-Referenzbild zu überlagern und beide Bilder gemeinsam zu visualisieren, nachdem sie in die gleiche geometrische Position gebracht wurden. Speziell entwickelte Bildverarbeitungsalgorithmen sorgen dafür, dass im Zuge der Bildüberlagerung die Transparenz des pH-Referenzbildes farbspezifisch optimiert wird. Die für die Analyse relevante Referenzlinie wird dadurch gut sichtbar. Gleichzeitig stören andere Regionen des pH-Referenzimages nicht bei der Betrachtung des EPO-Bildes. Die relative Durchsichtigkeit der beiden Bilder ist jederzeit frei einstellbar. Das überlagerte Bildpaar wird für die weitere Analyse verwendet, so dass die EPO-Isoformen mithilfe der pH-Referenzlinie richtig zugeordnet werden können.

Das Ziel der Bildanalyse ist die Analyse der EPO-Isoformenprofile der Probe - sowohl in ihrer absoluten Quantität als auch in ihrer Position relativ zu Isoformen der EPO-Standards. Als Referenz dient rekombinantes EPO in Form von Epo alfa, Epo beta oder Darbepoietin alfa. Sie repräsentieren die beim EPO-Doping verwendeten Pharmazeutika. Um eine Entscheidung über Positivität oder Negativität der Probe treffen zu können, müssen mehrere Fragen eindeutig und zuverlässig beantwortet werden. Diese lauten unter anderem: Welche Isoform bzw. Bande in der Probe ist die prominenteste, welche die zweitintensivste und welche die drittintensivste Liegen die prominentesten Banden nebeneinander? Liegen diese im basischen oder sauren Bereich des Geles?

In GASepo ist eine Methode zum Filtern des Rauschens implementiert, die aus Bildverarbeitungsmethoden für Röntgen- und Kerspinresonanztomographie stammt. Die so genannte „Geometry-Driven Diffusion (GDD) Filtering Methode“ basiert auf der mathematischen Analogie zu Diffusionsprozessen in Flüssigkeiten. Das Herz der Bildverarbeitung ist die Bandensegmentierung. Die Segmentierung ist eine Methode, um relevante Objekte in Bildern zu detektieren. Zum Beispiel können in einem Landschaftsbild mit einigen wenigen Häusern durch die Segmentierung alle Häuser als Einheit erkannt werden.

„Erkennen“ heißt in diesem Sinne alle Pixel markieren, die zu einem „Haus“ gehören. Die anderen Pixel bleiben unmarkiert. So werden die Häuser zu „Objekten“, und die restlichen Pixel (z.B. Bäume, Himmel, Gras usw.) bilden den „Hintergrund“. Wenn die „Hauspixel“ und die Hintergrundpixel gezählt werden, kann man die relative Größe der Häuser auf diesem Bild beurteilen. Auf den EPO-Bildern sind die Objekte der Segmentierung die Banden (Isoformen), der Rest bildet den Hintergrund. Die segmentierten Banden werden nach Volumen und Peakhöhe quantifiziert. Die Resultate werden übersichtlich in einer Bandentabelle dargestellt, was eine einfache Analyse der prominenten Banden ermöglicht.

Biochemisch betrachtet liefert rekombinantes EPO ein Isoformenmuster, das deutlich weiter in den basischen Bereich verschoben ist als das von endogenem EPO. Je höher folglich die therapeutische Dosis an rekombinantem EPO, desto weniger endogenes EPO wird produziert. Das Profil ändert sich daher zugunsten der rhEPO-Isoformen. Die Untergrenze der rekombinanten Isoformen wird als Trennlinie („cut-off-line“, COL) dargestellt.

Sorgfältige Dokumentation:Das A und O bei Analyseprozessen

Bei der Dopingkontrolle ist die sorgfältige Dokumentation des Analyseprozesses inklusive Bildverarbeitung das A und O. In GASepo wird einerseits jede Verarbeitungsphase im Endreport (als pdf-Dokument oder im MS-Excel-Format) dokumentiert. Andererseits enthält das „Session-File“, das zu jedem Zeitpunkt gespeichert werden kann, die kompletten zur Analyse verwendeten Daten. Aus dem Datensatz des Session-Files kann man den kompletten Analysevorgang rekonstruieren, es kann daher als Archivdokument verwendet werden. Das Session-File dient darüber hinaus zum Abspeichern von Zwischenergebnissen etwa bei Unterbrechen der Arbeit.

Die GASepo-Software wurde speziell für die EPO-Dopingkontrolle entwickelt und optimiert. Zusammen mit der epoCAM-Kamera stellt sie eine Systemlösung dar, die Voraussetzungen für die Standardisierung und Harmonisierung der EPO-Analytik schafft. Deswegen hat sich die WADA entschieden, das Projekt zu fördern und die Software dann unter akkreditierten Dopinglabors als das international einheitliche EPO-Analytikwerkzeug zu verbreiten. Die Entwicklung erfolgt im Rahmen von einem WADA-Projekt, bei dem sich die Vertreter der wichtigsten Dopinglabors in der Welt als Konsulenten und Beta-Tester beteiligen. Die Feuertaufe hat das System bereits bei den Olympischen Spielen in Athen absolviert, wo mehr als 300 EPO-Proben getestet wurden.

Austrian Reseach Centers

Die Austrian Research Centers ist die führende Institution der österreichischen außeruniversitären Forschung. Die ARC Seibersdorf research GmbH (ARCS) ist ihr größtes Tochterunternehmen. Das Geschäftsfeld Hochleistungsbildverarbeitung beschäftigt sich mit intelligenten Systemen zur schnellen optischen Qualitätsinspektion und zwei- und drei-dimensionalen Bildanalyse. Im Geschäftsfeld Chemische Analytik befindet sich das osterreichweit einzige WADA-akkreditierte Dopingkontroll- Labor. Das Labor steht für den österreichischen aber auch internationalen Sport als kompetenter Partner bei Trainings- und Wettkampfkontrollen sowie internationalen Sportveranstaltungen zur Verfügung. Ein wesentlicher Bestandteil der Tätigkeit ist auch Forschung und Entwicklung von neuen analytischen Methoden.

Erythropoetin- Analytik

Der Nachweis von Erythropoietin im Urin beruht auf der Methode der isoelektrischen Fokussierung (IEF). Basis für diese Methode sind die Ladungsdifferenzen von endogenem und rekombinantem Erythropoietin. Dabei wird die Probe auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen, das einen vorgeformten pH-Gradienten besitzt. Durch Anlegen eines elektrischen Spannungsgradienten wandern die Moleküle entsprechend ihrer Ladung bis zu jener Position, bei der ihre Nettoladung null beträgt. Dieser pH-Wert wird als pI-Wert bezeichnet. Auf diese Weise können die einzelnen EPO-Isoformen zu so genannten Banden fokussiert werden.

Die Proteine werden im Anschluss an die IEF „geblottet“: Durch Anlegen eines elektrischen Feldes werden die EPO-Banden vom Gel auf eine Membran übertragen. EPO-spezifischer Antikörper binden an die EPO-Isoformen. Nach einem weiteren Blot (dem so genannten Doppelblot) werden die EPO-Antikörper mit einem zweiten, enzymmarkierten Antikörper nachgewiesen. Nach Zugabe eines Substrates wird dieses durch das antikörpergebundene Enzym gespalten und zum Aussenden von Lichtquanten angeregt.Die EPO-Banden werden auf diese Weise sichtbar und darüber hinaus mittels Digitalkamera detektierbar gemacht.

*I. Holländer, C. Reichel und G. Gmeiner, ARC Seibersdorf research GmbH, A-2444 Seibersdorf, Österreich

Literatur:[1] Lasne F, de Ceaurriz J. Recombinant erythropoietin in urine. Nature (2000) 405, 605–635.[2] Breidbach A et al. Detection of recombinant human erythropoietin in urine by isoelectric focussing. Clinical Chemistry (2003) 49, 901–907.[3] Reichel Ch, Nagano M, Gmeiner G. Der Nachweis von Doping mit Erythropoietin. Österreichisches Journal für Sportmedizin (2003),3, 31–35.[4] Bajla et al. An alternative method for electrophoretic gel image analysis in the GAS2 software. Methods and Programs in Biomedicine (in press).

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