Metabolomik-Studien: der Stoffwechsel in Gänze

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Redaktionsbüro Guido Deußing

Bei der Extraktion der Lipide wurde wie folgt vorgegangen: Ein Gramm Pflanzenmaterial wurde mit 6 mL einer Mischung aus Chloroform und Methanol (2:1) versetzt und extrahiert. Zur Lösung wurden 4 mL Wasser dosiert. 1,5 mL der Chloroform-Phase wurden entnommen, gefiltert und in ein Vial überführt. Anschließend erfolgte die Verdampfung des Lösemittels in der MVAP-Station. Die Extrakte wurden in 300 µL Chloroform aufgenommen und einer SPE über eine NH₂-Phase unterzogen, um die darin enthaltenen Lipidklassen vor ihrer LC/MS-Bestimmung zu fraktionieren:

Es wurden 3 mL einer Lösung bestehend aus Chloroform und Isopropanol (2:1) verwendet, um die neutralen Lipide (NL) von der NH₂-Phase zu eluieren. Für die Fraktionierung der freien Fettsäuren (FF) wurden jeweils 4 mL einer Lösung bestehend aus einer zweiprozentigen Essigsäure in Diethylether verwendet; die Extraktion der polaren Lipide (PL) erfolgte mit 3 mL Methanol. Allein die SPE-Schritte zur Fraktionierung der verschiedenen Lipidfraktionen würde, manuell ausgeführt, sehr viel Zeit in Anspruch nehmen. Die Automatisierung erweist sich hier als Schlüssel zur Steigerung der Produktivität, erlaubt sie doch die Abwicklung unbeobachtet vom Laborpersonal auch in der Nacht oder am Wochenende.

Die drei Fraktionen wurden in 10-mL-Vials gesammelt und in der MVAP-Station bis zur Trockne eingedampft. Die Aufnahme des Rückstands und anschließende LC/MS-Analyse erfolgte in einer Lösung bestehend aus Chloroform und Isopropanol. Die Lösemittelmengen wurden gemäß der Konzentration der Lipide in den Extrakten optimiert [2].

Für die Analyse der Extrakte verwendet wurde ein Agilent 1290 UHPLC-System, das mit einem 6540-Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometer (QTOF) verbunden war. Die LC-Trennung der Analyten erfolgte auf einer C18-Reversed-Phase-Säule mit 20 mM Ammoniumformat in Wasser und Methanol als mobiler Phase [4]. Insgesamt wurde mit vier verschiedenen LC/MS-Methoden gearbeitet, die sich im Wesentlichen in leicht divergenten Lösemittelgradienten und MS-Bedingungen unterschieden: Die Kationen aus Fraktion 1 wurden analysiert mittels Elektrospray-Ionisierung (ESI POS) bestimmt, Fraktion 2 wurde analysiert im negativen ESI-Modus (ESI NEG) und Fraktion 3 in beiden Modi (ESI POS und ESI NEG).

Erfolgreicher Einsatz der Automatisierung

Für eine Lipidomik-Studie an Pflanzen wurden insgesamt 84 Proben mit der oben beschriebenen automatisierten Methode analysiert. Der Probenbestand setzte sich zusammen aus 22 individuellen Pflanzenproben, die sich drei Hauptarten zuordnen ließen, und die jeweils dreifach aufbereitet und analysiert wurden. Zusätzlich wurden 18 Qualitätskontrollproben (QC) analysiert, um die Wiederholbarkeit der Probenbereitung sowie das LC/MS-Protokoll zu bewerten. Detektiert wurden (Spur A) Monoglyzeride (MGs), Diglyzeride (DGs), Triglyzeride (TGs) und Pflanzensterole. Spur B zeigt die Analyse von in Fraktion 2 vorhandenen langkettigen freien Fettsäuren (LCFAs) im ESI-NEG-Modus. Die Spuren C und D zeigen die Detektion von Phospholipiden (PLs), Sphingolipiden und anderen polaren Lipiden im ESI-POS- bzw. ESI-NEG-Modus (s. Abb. 2). Um die Genauigkeit der Messung bewerten zu können, wurde eine Reihe der identifizierten Verbindungen ausgewählt und die Standardabweichungen der Flächen in Prozent (RSD%) berechnet. Für Lipidomik-Studien liegt der Testwert (Cut-off-Wert) für die Flächen-RSD-Werte in der Regel bei 30% [5]. Bemerkenswert ist, dass bei den untersuchten 18 QC-Proben die relative Standardabweichung für alle Analyten kleiner als 25% und für die Hälfte der Analyten sogar kleiner als 12% war.

Bemerkung zum Schluss und Ausblick

Wie die Untersuchung ergab, erweist sich die Gerstel-MPS-Workstation mit zwei Armen (Dual-Head-Version) als besonders gut geeignet für die Automatisierung der Probenbereitung im Rahmen von Metabolomik-Studien, wie der hier beschriebenen Bestimmung von Lipidklassen in Pflanzenmaterial. Eine Methode für die Fraktionierung von Lipiden auf SPE-Basis wurde mit einer zweckbestimmten Konfiguration vollständig automatisiert, einschließlich der Aufkonzentrierung von SPE-Fraktionen mittels Lösemittelverdampfung. Die LC/QTOF-Analysen der Fraktionen ergaben eine ausgezeichnete Wiederholbarkeit der Bestimmungen.

In einem weiteren Artikel wird die Automatisierung eines Derivatisierungsprotokolls für die Anwendung im Rahmen der Analytik für Metabolomik-Studien beschrieben.

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