Biosensoren Optische Biosensoren aus Lipid-Gitter

Stellen Sie sich vor, Ihr Arzt entnimmt Ihnen einen Tropfen Blut und analysiert diesen innerhalb der nächsten Minuten noch in der Praxis; und zwar auf Krebs, HIV und weitere in Blut sichtbare Erkrankungen. Biokompatible Lipid-Beugungsgitter auf einem Chip könnten dies schon bald ermöglichen.

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CANDOR Bioscience GmbH

Socorex Isba SA

Anton Paar Germany GmbH

Westf. Wilhelms-Universität Fachbereich Physik

Optische Beugungsgitter müssen nicht starr sein. Bestehen sie aus Lipid-Multilagen, entfalten sie eine Reihe von Eigenschaften, die sich für die Verwendung von Biosensoren auszeichnen. Mit solchen Beugungsgittern ist es möglich, ohne Farbstoffmarkierung (Fluoreszenz) spezifisch Zielmoleküle in Flüssigkeiten aufzuspüren, so z.B. Proteine in Serum [1]. Das Verfahren der Dip-Pen Nanolithography (DPN) bietet sich an, auf beliebigen, ggf. prästrukturierten Oberflächen Lipid-Gitter zu schreiben [2]. Dies ermöglicht die pa-rallele Herstellung von bis zu 55 000 individuell biokompatiblen Gittern in wenigen Minuten auf einem 2 cm2 großen Chip [3].

State of the Art

Eine etablierte und einfache Methode zur Analyse von Blutproben ist der ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Ein Nachteil ist jedoch, dass jeder Test separat durchgeführt werden muss. Eine neue Methode, welche in einem Schritt alle Tests integrieren würde, könnte neue Horizonte der klinischen Analyse eröffnen.

Biosensoren basierend auf Beugungsgitter bieten eine Möglichkeit auf Fluoreszenz-Marker zu verzichten. Die Bindung von Analyten an die in der Gitteroberfläche integrierten Akzeptor-Moleküle führt zu einer Änderungen im Beugungsbild. Das daraus resultierende Signal bietet Aufschluss über Art und Konzentration des Analyts. Die Herstellung der Gitter sowie die Auswertung der einzelnen Signale sind jedoch kompliziert. Die Herstellung solcher mehrfach biofunktionaler Gitter lässt sich über die Dip-Pen Nanolithography realisieren.

Dip-Pen Nanolithography

Das makroskopische Analogon zum DPN-Verfahren ist das Schreiben mit einer Feder, die vorher in ein Tintenfass getaucht wurde. Im mikroskopischen Verfahren werden Spitzen eines atomaren Kraftmikroskopes (AFM) als Feder und in diesem Fall Phospholipide als Tinte verwendet. Die Spitzen werden hierzu zunächst in kleinste Reservoire (Mikrofluidik) eingetaucht, sodass die Spitzenoberfläche von einer Lipidschicht überzogen wird. Eine Piezo-Steuerung lässt eine beliebige zweidimensionale Bewegung der Spitze auf der Oberfläche zu. Der Schreibprozess findet bei normalen Laborbedingungen unter definierter Luftfeuchtigkeit statt. Um ein paralleles Schreiben zu ermöglichen, können Spitzen ein- und zweidimensional nebeneinander angeordnet werden. Ein individuelles Betanken der Spitzen erfolgt über spezielle Reservoir-Vorrichtungen sowie über Inkjet-Printing.

Funktionalität über Lipid-Multilagen

Lipide und Proteine sind die Hauptbestandteile biologischer Membrane, die im Zusammenspiel in natürlichen Systemen bereits Biokompatibilität zeigen und als molekulare Signalverstärker fungieren. Daher zeigen Lipide ideale Voraussetzungen für Anwendungen im Biosensor-Bereich. Die Herausforderung, das Auslesen des Signals makroskopisch durchzuführen, kann nun optisch mit Lipid-Gittern erfolgen.

Ihre Eigenschaft zur Selbststrukturierung in Flüssigkeit ermöglicht die Bildung von Biomembranen und Liposomen. Lipide eignen sie sich dabei sehr gut als Tinte: Adhäsionskräfte zwingen die Lipide, bei Berührung der Oberfläche die Spitze zu verlassen und Multilagen zu bilden. Durch Kontrolle von Kontaktzeit und Luftfeuchtigkeit lässt sich die Höhe der Struktur bestimmen. Es konnte gezeigt werden, dass die flüssigen Lipid-Multilagen-Strukturen nach Eintauchen in wässrige Analytflüssigkeit stabil sind. Diese Eigenschaft ist fundamental wichtig für biosensorische Experimente an diesen Lipid-Gittern.

Schreiben mit der Nano-Feder

Die hier vorgestellten Gitter sind von 26 nebeneinander angeordneten Spitzen auf poly(methyl methacrylate) (PMMA) geschrieben worden (s. Abb. 1). Als Tinte fungieren Phospholipide der Art 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DOPC); teilweise in Anreicherung mit Biotin (DOPE) zur Funktionalisierung. Die Gitter weisen bei einem Linienabstand von 500 bis 2500 nm eine Feldlänge von bis zu 30 µm auf. Ihre Profilhöhe beträgt von einer Lipid-Doppellage (ca. 4 nm) bis zu 70 nm (s. Abb. 2a, c).

Bei einem hohen Materialtransfer von Spitze zu Oberfläche ist eine Fusion der einzelnen Linien während des Schreibprozesses möglich (s. Abb. 2d).

Optische Strukturen, wie Gitter, bieten sich darüber hinaus hervorragend an, die Qualität eines Schreibprozesses zu beurteilen. Während bisher Fluoreszenz- oder AFM-Aufnahmen nötig waren, ist es nun möglich, selbst während der Lithographie in situ die Strukturen zu beleuchten und ihr Beugungsbild zu bewerten. Hierfür eignet sich eine einfache CCD-Kamera an einem Mikroskop (s. Abb. 2a). Das Verfahren erlaubt es, über die Intensität der Beugung, Rückschlüsse auf die einzelnen Profilhöhen zu treffen. Selbst in Flüssigkeit lassen sich so die Gitter bezüglich ihrer Höhen kalibrieren.

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