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Gerstel GmbH & Co. KG

Redaktionsbüro Guido Deußing

Shimadzu Deutschland GmbH

Axel Semrau GmbH /Trajan Scientific and Medical

Allein die Vorbereitung der einzelnen Proben und damit ihre Überführung in eine GC/MS-gängige Form, erweist sich als sehr arbeits- und zeitintensiv sowie auch potenziell fehleranfällig, so man den konventionellen Weg wählt. Ein weiteres Manko zeigt sich, wenn eine große Probenzahl in einem Analysenlauf zu bearbeiten und zu vermessen ist: High-Throughput-Screening (HTS) ist in Metabolomics-Studien keine Seltenheit. Zwar lasse sich die erforderliche Inkubationszeit – Beale und Karpe sprechen von 60 bis 120 Minuten pro Probe – durch eine unterstützende Mikrowellentemperierung auf rund zehn Minuten verkürzen (3 min Reaktionszeit und 7 min Abkühlphase). Allerdings seien damit hohe Kosten für die Anschaffung der Mikrowellentechnologie verbunden.

Ein weiteres Problem, das aus längeren Wartezeiten bis zur Analyse resultiert, ist der chemische Abbau der erzeugten TMS-Derivate (TMS: Trimethylsilyl). Dieser variiert von Probe zu Probe, in Abhängigkeit von der Wartezeit bis zur Analyse: Werden alle Proben einer Charge zeitgleich derivatisiert und zur Analyse gegebenen, führt das unweigerlich dazu, dass der zeitliche Abstand von Probenvorbereitung und Analyse der ersten Probe signifikant anders ist als jener der letzten Probe.

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Das bedeutet: Der unterschiedliche Degenerationsgrad der Metaboliten zwischen den einzelnen Proben sowie auch die mögliche Entstehung unterschiedlicher TMS-Derivate hat zur Folge, dass die gleiche Probe aufgrund des zeitlichen Abstands sowie der fortschreitenden chemischen und Degenerationsprozesse in der Probe zu unterschiedlichen Messergebnissen und größeren relativen Standardabweichungen (RSD) führt.

Verschachtelung als Lösung

Die Lösung des Dilemmas liegt in einer Online-Analyse und damit verbunden in der zeitlichen Verschachtelung von Probenvorbereitung und GC/MS-Analyse. Nur auf diese Weise lasse sich sicherstellen, sind Beale und Karpe überzeugt, dass der zeitliche Abstand von der Derivatisierung bis zur Injektion ins GC/MS-System bei jeder Probe identisch ist und die erzeugten Metaboliten von Probe zu Probe vergleichbare Verweilzeiten haben sowie Degenerationsprozesse von Probe zu Probe in einem vergleichbaren und reproduzierbaren Umfang stattfinden.

Dieser applikative Ansatz, also die Gewährleistung gleicher Zeitabstände in der Analyse von großen Probensätzen, erfordert eine entsprechendes technisches Equipment, dass Udo Rupprecht von Lasersan Aus­tralasia, der für Australien und Neuseeland zuständige Distributionspartner der Gerstel GmbH & Co. KG, gemeinsam mit Beale und Karpe entwickelt und in der Laborpraxis der Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO) installiert hat.

Im Zentrum der Online-Lösung steht ein leistungsfähiger Autosampler (Gerstel-MPS robotic pro), dessen Universalspritzenmodul zwecks Dosierung der erforderlichen unterschiedlichen Lösungsmittel- und Probenvolumina mit drei unterschiedlich dimensionierten Spritzen ausgestattet ist (500, 100 und 10 µL), hinreichend Platz für die Bevorratung einer großen Zahl an Reagenz- und Probenfläschchen (MeOH, BSTFA/MSTFA, Standardlösungen) in gekühlten und vor Licht geschützten Schubladentrays bietet und zudem über eine temperierbare Schütteleinheit verfügt. Gemäß des mittels Steuersoftware (Gerstel-Maestro) programmierten Workflows werden die Proben sukzessive und zeitlich verschachtelt (Prepahead-Funktion) vollständig automatisiert vorbereitet und in das angeschlossene GC/MS-System (Agilent Technologies GC 7890B, MSD 5977B) injiziert. (Weitere technische und applikative Details siehe [4]. Anmerk. d. Red.)

Was am Ende zu sagen bleibt

Beale, Karpe und Rupprecht ziehen nach Abschluss ihrer Methodenentwicklung und Etablierung des hier beschriebenen, für Hochdurchsatz-Metabolomics-Studien entwickelten GC/MS-Systems mit vollständiger Automatisierung der Probenvorbereitung und Probenaufgabe folgendes Fazit: „Unsere Anwendung demonstriert, dass ein hoher Probendurchsatz möglich ist. Das zugrundeliegende Protokoll erlaubt es, mehr als 80 Proben auf den Punkt genau vorzubereiten und online zu analysieren.

Unter Verwendung weiterer peltiergekühlter Probenbehälter lässt sich die Probenzahl auf 200 bis 300 in einem Arbeitslauf erhöhen.“ Um einen reibungslosen, von Laborpersonal unbegleiteten zuverlässigen Analysenverlauf über Nacht und auch am Wochenende zu gewährleisten, lassen sich ein automatisierter Liner-Wechsel (hier: Gerstel-Automated Liner Exchange, ALEX) sowie weitere Module in den MPS-Autosampler integrieren. Da­rüber hinaus minimiere die von ihnen etablierte automatisierte Probenvorbereitung und Probenhandhabung potenzielle Fehler(quellen), die einer Derivatisierung großer Chargen immanent sind, so die Forscher. „Mit dem von uns verwendeten Autosampler (MPS robotic pro) gelingt es, einzelne Proben zu einem genau definierten Zeitpunkt (in time) vor der Injektion in das GC/MS-System zu derivatisieren, wodurch der Grad der Degeneration von Metaboliten und der Bildung von Derivaten unterschiedlicher Ausprägung während der gesamten Sequenz signifikant reduziert wird.“

Wie Beale und Karpe berichten, habe ihre Vorgehensweise die relative Standardabweichung (RSD) der Mess­ergebnisse im Vergleich zu konventionell weit verbreiteten Offline-Ansätzen signifikant verbessert – Resultat der Kombination aus der zeitnahen Derivatisierung der Proben mit dem MPS-Autosampler, dem präzisen automatisierten Transfer der Reagenzmengen und einer minimierten Anzahl an Septumpunktionen, die Fehlern aufgrund eines Analyten-Abbaus in den Prozess eintragen können. Letztlich habe ihr automatisiertes Analysenprotokoll den Verbrauch an Reagenzien wie auch die investierte Arbeitszeit signifikant reduziert und damit die gesamte Analyse nicht nur effizienter und verlässlicher, sondern auch wirtschaftlicher gemacht. Referenzen

[1] Anja Braun, Hunde erschnüffeln Corona-Infektion, SWR, 24 September 2020, https://www.swr.de/wissen/hunde-sollen-corona-erschnueffeln-102.html#:~:text=In%20der%20finnischen%20Hauptstadt%20Helsinki,sollen%20Infizierte%20am%20Flughafen%20erschn%C3%BCffeln.&text=Experten%20sagen%2C%20dass%20speziell%20trainierte,bei%20den%20Menschen%20Symptome%20auftreten.

[2] Tobias Hüser, Forscher wollen Parkinson-Patienten am Geruch erkennen, Laborpraxis (2017), https://www.laborpraxis.vogel.de/forscher-wollen-parkinson-patienten-am-geruch-erkennen-a-673541/

[3] Fong et al., Trace Ethylene Sensing via Wacker Oxidation, ACS Central Science (2020), https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c00022

[4] David Beale, Avinash Karpe und Udo Rupprecht, In-time TMS derivatization and GC/MS determination of Sugars, Organic Acids and Amino Acids for High Throughput Metabolomics Studies, GERSTEL Application Note 216 (2020), http://www.gerstel.ch/pdf/AppNote-216.pdf

[5] Oliver Fiehn, Metabolomics by gas chromatographiy-mass spectrometry: Combined targeted and untargeted profiling, Current protocols in Moleculoar Biology 114 (2016), https://doi.org/10.1002/0471142727.mb3004s114

[6] https://www.fishersci.de/shop/products/bstfa-silylation-reagent/p-4527566

* *G. Deußing Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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