Schnelle In-Vitro-Diagnostik des H1N1-Virus mittels PCR

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Die enorme Geschwindigkeit des Gesamtsystems ist auf die neue Gerätetechnik (s. Abb. 2) und die neu entwickelte Chemie der Analytik Jena und AJ Innuscreen zurückzuführen. Der neue Assay ermöglicht nun die Gewinnung der A/H1N1-Virus-RNA mittels automatisierter Nukleinsäureextraktion unter Verwendung des King-Fisher ml oder Flex über eine Magnetpartikelseparation. Für einen geringeren Probendurchsatz steht außerdem eine manuelle RNA-Aufreinigung unter Nutzung von Spin-Filter-Säulen zur Verfügung. Die isolierte RNA wird in eine für A/H1N1-Viren spezifische RT-PCR (Reverse Transkription) eingesetzt. Anschließend wird die cDNA einer Amplifizierungsreaktion mit spezifischen Primern unterzogen. Die Amplifikation wird dabei im gleichen Gefäß durch eine nachfolgende Hybridisierungsreaktion mit einer A/H1N1-spezifischen Sonde kombiniert. Das Reaktionsformat erlaubt damit den spezifischen Nachweis der A/H1N1-RNA und verhindert das Auftreten von falsch positiven Ergebnissen infolge eines Mispriming. Die Amplifizierungsprotokolle sind sowohl an die rapidPCR-Technologie mit einem Low-Profile-Rapid- (LPR) Block oder einem Standard-Profile-Rapid- (SPR) Block (Speed-Cycler2 oder AlphaSC; Analytik Jena) angepasst, als auch auf die Verwendung mit Standard-Thermocyclern, wie dem TProfessional (Biometra) optimiert. Der Vorteil der rapidPCR besteht darin, dass die Testdurchführung in weniger als einer Stunde abgeschlossen ist. Abschließend erfolgt die Visualisierung und Auswertung des Amplifikations-Hybridisierungs-Ergebnisses unter Nutzung anwendungsfreundlicher Teststreifen. Dazu wird das PCR-Produkt auf einen Lateral Flow Dipstick (LFD) aufgetragen (s. Abb. 3B). Das positive PCR-Hybridisierungsergebnis wird durch Erscheinen einer Testlinie bestätigt. Zur Absicherung der korrekten Funktion des Teststreifens erscheint zusätzlich eine Kontrolllinie.

Validierung und Leistungsmerkmale

Der Ready-to-Use-Kit detektiert die Zielsequenz Haemagglutinin der A/H1N1-RNA (Schweinegrippe) in Abstrichproben des Rachens oder des Nasopharyngealtraktes. Die veröffentlichten Leistungsmerkmale dieser Methode wurden am gezüchteten Virusmaterial (A/California/04/ 2009,A/Hamburg/4/2009) und über 200 Patientenproben verifiziert (s. Tab. 1). Als Referenzmethode diente eine Realtime-PCR (s. Abb. 3A) mit den vom Robert-Koch-Institut entwickelten und publizierten Primer- und Sondensequenzen (RKI NIC Influenza 20.05.2009). Weiterhin wurden Versuche zur Kreuzreaktivität mit anderen Influenza-A-Virusstämmen und humanem Genmaterial von gesunden Probanden erfolgreich durchgeführt. Die Reproduzierbarkeit und Nachhaltigkeit der Methode wurde an über 2000 Patientenproben getestet.

Ergebnisdarstellung und Auswertung

Der rapidSTRIPE H1N1 Detection Assay unter Nutzung eines Lateral Flow Dipsticks (LFD) zeigt im Vergleich zur herkömmlich etablierten Realtime-PCR des gleichen Genabschnittes eine übereinstimmende Sensitivität (s. Abb. 3). Mindestens 20 cDNA-Moleküle des Erregers werden in einem PCR/Hybridisierungsansatz nachgewiesen. Dies entspricht etwa 2000 Virus-RNA-Molekülen im 120 µl RNA-Eluat bzw. etwa 2500 Viruspartikeln in der Ausgangsprobe (z.B. Swab). Darüber hinaus bietet Analytik Jena mit dem neuen Assay das derzeit einzige am Markt erhältliche CE-IVD-Produkt zum Nachweis von Influenza A/H1N1-Viren. In die Zertifizierung eingeschlossen sind die Nukleinsäureisolierung mittels King-Fisher ml oder Flex, die cDNA-Synthese und PCR mittels AlphaSC oder TProfessional sowie die finale Detektion über einen Teststreifen. Seit Anfang 2010 sind auf Basis der neuen Detektionssysteme ebenso Kits für die Detektion von Influenza A und B erhältlich.

Literatur

[1] World Health Organization http://www.who.int/csr/disease/swineflu/laboratory22_01_2010/en/index.html [05.02.2010]

[2] http://www.sozialministerium.hessen.de/irj/HSM_Internet?cid=63f1772a6ee38341b9e6dce63a1620e4 [05.02.2010]

[3] Robert Koch Institut: (RKI): http://www.rki.de/cln_153/nn_200120/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaet-ter/Ratgeber__Mbl__Influenza.html [05.02.2010]

[4] Bundesministerium für Gesundheit: http://www.bmgfj.gv.at/cms/site/news_detail.html?channel=CH0525&doc= CMS1240819590724 [05.02.2010]

[5] http://de.wikipedia.org/wiki/Pandemie_H1N1_2009 [04.02.

[6] Freundlich zur Verfügung gestellt durch das Robert Koch Institut (RKI) Berlin [2009]2010]

*Analytik Jena AG, Business Unit ‚Life Science’, 07745 Jena

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