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Durchflusszytometrie Schneller Nachweis humaner Leukozyten-Antigene

Autor / Redakteur: Jürgen Kunz* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Bestimmung des humanen Leukozyten-Antigen HLA-B27 ist in der Rheuma-Diagnostik seit vielen Jahren etabliert. Für die preiswerte und schnelle Diagnostik steht eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Verfügung, die in über 99 Prozent der Fälle ein eindeutiges Ergebnis liefert. Benötigt werden nur 0,2 Milliliter EDTA- oder Heparin-Blut. Die Bestimmung ist auch nach drei bis fünf Tagen noch zuverlässig möglich.

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Abb. 1 Durchflusszytometrischer Nachweis des HLA-B27-Antigens auf T-Lymphozyten. Details siehe Bildergalerie.
Abb. 1 Durchflusszytometrischer Nachweis des HLA-B27-Antigens auf T-Lymphozyten. Details siehe Bildergalerie.
( Archiv: Vogel Business Media )

HLA-Antigene (Humane Leukozyten-Antigene) kommen nicht nur auf Leukozyten, sondern auf allen Körperzellen vor und werden auch als MHC-Antigene (Major-Histocompatibility-Complex-, Haupthistokompatibilitäts-Antigene) bezeichnet. Da sie die Grundlage für die immunologische Erkennung von körpereigen und körperfremd bilden, ist die komplette HLA-Typisierung vor Organtransplantationen unerlässlich.

Bei einigen Erkrankungen finden sich bestimmte HLA-Determinanten signifikant gehäuft [1]. Als Ursache für diese HLA-Assoziation wird vermutet, dass entweder vom Organismus gebildete Antikörper gegen Infektionserreger mit einigen HLA-Antigenen kreuzreagieren oder Medikamente, Gifte oder andere Fremdstoffe sich bevorzugt an bestimmten HLA-Strukturen anlagern und gegen diesen Komplex Antikörper gebildet werden. Durch Vergleiche mit Kontrollgruppen werden für die Träger einzelner HLA-Antigene relative Risiken (rR) für verschiedene Erkrankungen berechnet. Ein relatives Risiko größer Eins gibt ein erhöhtes, ein relatives Risiko kleiner Eins ein herabgesetztes Risiko (Schutzfunktion des Allels) an.

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Das am häufigsten bestimmte HLA-Antigen ist das HLA-B27. Personen, die dieses Antigen besitzen, haben im Vergleich zu HLA-B27-negativen Personen ein erhöhtes Risiko für verschiedene Erkrankungen (s. Tab.1) [1]. Aufgrund der ausgeprägten Assoziation mit M. Bechterew, Reiter-Syndrom und infektiösen Arthritiden ist die Kenntnis des HLA-B27-Status in der Differential-Diagnostik von Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises von großer Bedeutung. Bei der Befundinterpretation ist aber zu beachten, dass zwar 95 Prozent aller Patienten mit M. Bechterew HLA-B27-positiv sind, aber nur 20 Prozent aller HLA-B27-positiven Personen im Laufe ihres Lebens an einem M. Bechterew erkranken.

Bestimmung humaner Leukozyten-Antigene im Labor

Bis etwa 1990 war der Zytotoxizitätstest nach Terasaki und McClelland [2] die einzige Methode für die Bestimmung des HLA-B27. Benötigt wurden dafür zehn Milliliter frisches Heparinblut. Aus dem Blut werden die Lymphozyten in einer Dichtezentrifugation angereichert und die lebenden Zellen mit humanen Antiseren bekannter HLA-Spezifitäten inkubiert. Durch anschließende Zugabe von Kaninchen-Komplement werden nur die Zellen mit den gesuchten HLA-Antigenen spezifisch geschädigt. Die Zellen schwellen an, nehmen den zugegebenen Farbstoff Eosin auf und erscheinen im Lichtmikroskop als größere dunkle Zellen. Die Zuverlässigkeit des Zytotoxizitätstests hängt entscheidend vom Alter der Blutprobe, der Auswahl der polyklonalen humanen Antiseren, der Qualität des Komplements und der Erfahrung des Untersuchers ab. In der Routinediagnostik war der Test oft nicht auswertbar und musste wiederholt werden.

Durchflusszytometrie verbessert die Analytik

Die durchflusszytometrische Methode benötigt nur 0,2 ml EDTA- oder Heparin-Blut und stellt eine wesentliche Verbesserung und Vereinfachung der Analytik dar [3, 4]. Die Leukozyten werden mit einem monoklonalen Antikörper gegen HLA-B27 inkubiert, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Die Messung erfolgt am Durchflusszytometer. Diese Geräte können in fünf Sekunden 30 000 Zellen gleichzeitig auf Größe, Granularität und Bindung von zwei bis sechs verschiedenfarbig markierten monoklonalen Antikörpern untersuchen.

In einer Multicenter-Studie [4] konnte gezeigt werden, dass mit dem primär eingesetzten HLA-B27-Antikörper alle HLA-B27-negativen Proben (79,7 Prozent der 1432 untersuchten Blutproben) richtig erkannt wurden. Aufgrund der enormen Vielfalt der HLA-Antigene, kann auch ein monoklonaler HLA-B27-Antikörper nicht völlig frei von Kreuzreaktionen mit anderen HLA-Antigenen sein. 2,1 Prozent der untersuchten Proben zeigten eine Kreuzreaktion.

Vollautomatische Auswertung

Auf Grundlage der Studie hat Becton Dickinson, San Jose ein HLA-B27-Diagnostik-Kit mit FDA-Zulassung (amerikanische Food and Drug Administration) erstellt, das mithilfe eines Kalibrators einen Grenzmedian definiert und eine vollautomatische Auswertung ermöglicht. Die Leukozyten werden mit einem monoklonalen Antikörper gegen HLA-B27 inkubiert, der mit einem grünen Fluoreszenzfarbstoff (FITC) markiert ist. Gleichzeitig wird ein rot (PE) markierter Antikörper gegen CD3 hinzugegeben. CD3 ist ein Antigen, das nur die stabileren T-Lymphozyten, nicht dagegen die labileren Granulozyten oder Monozyten auf ihrer Membranoberfläche tragen. Bei der automatischen Auswertung am Computer werden diejenigen Zellen ausgewählt, die in Größe und Granularität den Lymphozyten entsprechen (s. Abb. 1a) und das CD3 der T-Lymphozyten tragen (rot fluoreszierend, Abb. 1b). Dadurch ist es möglich, die Bindung des HLA-B27-Antikörpers (grüne Fluoreszenz) nur auf intakten T-Lymphozyten auszuwerten (s. Abb. 1c). Ausgewertet wird die Bindung des grün markierten HLA-B27-Antikörpers (grüne Fluoreszenzintensität) auf den T-Lymphozyten. Störungen durch Zelldetritus (Granulozyten-, Monozyten-, Lymphozyten- oder Erythrozytenfragmente) werden ausgeschlossen. Auf diese Weise ist die Analytik noch mit drei bis fünf Tage alten Proben zuverlässig möglich, sodass der Postversand sowie die Blutentnahme am Freitag keine präanalytischen Probleme verursachen.

Verifikation der Ergebnisse

Während die FDA eine Rate von 2,1 Prozent falsch positiver Resultate akzeptiert hat, werden im LADR-Laborverbund die im ersten Ansatz positiven Proben mit einem zweiten monoklonalen HLA-B27-Antikörper (Antikörper von One Lambda, vertrieben von medac, Hamburg) bestätigt. Dieser Antikörper ist gegen ein anderes Epitop des HLA-B27-Antigens gerichtet und zeigt daher völlig andere Kreuzreaktionen. Sind beide Teste positiv, ist das HLA-B27-Antigen zweifelsfrei nachgewiesen. Bei Diskrepanzen kommt ein dritter HLA-B27-Antikörper (Beckman, Krefeld) zum Einsatz, der mit einem HLA-B7-Antikörper (B7 verursacht die meisten Kreuzreaktionen) kombiniert ist. Die einzelnen kreuzreagierenden HLA-Antigene der kommerziell erhältlichen HLA-B27-Antikörper wurden inzwischen ausführlich untersucht. Abbildungen 1, 2 und 3 zeigen den Labor-Report einer negativen und zweier als positiv bewerteter Proben. Der Grenzmedian wurde auf 145 eingestellt und kann von Lot zu Lot leicht variieren. Jahrelange Erfahrung mit dem Testsystem und regelmäßige Vergleiche mit der PCR haben gezeigt, dass alle Proben, deren Median den Grenzmedian um mindestens zehn übersteigt (hier ab 155) als sicher HLA-B27-positiv zu werten sind. Nur Proben mit einem Fluoreszenzmedian zwischen 145 und 154 werden mit einem zweiten und ggf. dritten Antikörper nachgetestet. Die Probe in Abbildung 2 stellte sich als HLA-B7-positiv (häufigste Kreuzreaktion), aber HLA-B27-negativ heraus. In nur noch weniger als 0,1 Prozent der Fälle wird die PCR, die heute in vielen Laboratorien verfügbar ist, zur letzten Absicherung benötigt. Zur Bestimmung des HLA-B27 ist die PCR als dritte Methode absolut zuverlässig, aber zeitaufwändiger und teurer als die Durchflusszytometrie.

Literatur

[1] Leibold W. Haupthistokompatibilitätsantigene (MHC-Antigene) und Krankheitsdispositionen, in Thomas L., Labor und Diag-nose. Die Medizinische Verlagsgesellschaft Marburg 1992; 4. Auflage: 1106-1132

[2] Terasaki PI, Mc Clelland, JD. Microdropelet assay of human serum cytotoxins. Nature 1964; 204: 998-1000

[3] Kunz J., Albrecht J. Die HLA-B27-Typisierung mit Hilfe der Durchflusszytometrie im Routinelabor. Lab.med. 1991; 15: 1-5

[4] Hulstaert F., Albrecht J., Buchner L., Kunz J., Falkenrodt A., Tongio M., de Keyser F., Veys EM, Noens L., Mir N., Costello C., Strauss K., An optimized method for routine HLA-B27 screening using flow cytometry. Cytometry 1994; 18: 21-29

*Dr. J. Kunz, LADR GmbH, Medizinisches Versorgungszentrum Dr. Kramer und Kollegen, 21502 GeesthachtTel. +49 (0) 41 52 / 8 03 - 1 66

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