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TOC-Analyse Swab-Test von E.coli-Zellen mittels TOC-Analyse

Autor / Redakteur: Bettina Gierszewski* und Ulrich Servos* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Besonders in der Arzneimittelproduktion ist die Reinigungsvalidierung äußerst wichtig. Die Bedeutung des Swab-Tests als eine Methodik nimmt daher immer mehr zu. Er lässt sich beispielsweise mit der TOC-Analyse zur Feststoffbestimmung direkt vermessen. Methode, Probenvorbereitung, Kalibration, Durchführung und Messergebnisse werden beschrieben.

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Abb. 1 TOC-VCSH mit ASI-V und Feststoffmodul SSM-5000A.
Abb. 1 TOC-VCSH mit ASI-V und Feststoffmodul SSM-5000A.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Reinigungsvalidierung belegt die Wirksamkeit eines Reinigungsverfahrens in der Arzneimittelproduktion. Eine gut gereinigte Anlage verhindert die Kontamination und somit die Verfälschung des produzierten Medikaments.

Je nach Produktions- und Reinigungsverfahren gibt es verschiedene Möglichkeiten der Probennahme, um die durchgeführte Reinigung effektiv zu überprüfen. Neben der einfachen und schnellen Final-Rinse-Probe, nimmt die Bedeutung des Wischtests (Swab-Methode) immer mehr zu. Der Wischtest (Swab) wird für die Beprobung von sichtbaren Rückständen verwendet. Dazu zählen Überzüge, Krusten, Anbackungen in Winkeln und Ecken und besonders schwer lösliche Substanzen.

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Der verwendete Swab kann entweder in einem Lösungsmittel extrahiert werden (nachfolgend wird dann die Extraktionslösung analytisch bestimmt) oder der Swab wird direkt vermessen. In diesem Artikel wird die direkte Bestimmung des Swabs mittels der TOC-Feststoffbestimmung am Beispiel von E.coli-Zellen vorgestellt.

TOC-Analyse in der Reinigungsvalidierung

Die TOC-Analytik bestimmt den Summenparameter des gesamten organischen Kohlenstoffs. Dabei wird der Kohlenstoffanteil der Probe zu Kohlendioxid oxidiert und mit einem NDIR-Detektor (nicht dispersiver IR-Detektor) analysiert. Wässrige Proben lassen sich somit schnell und einfach analysieren. Die gesamte Analysenzeit beträgt etwa vier Minuten. Aus diesem Grund setzt sich die TOC-Analytik in der Reinigungsvalidierung zur Bestimmung der Final-Rinse-Probe immer mehr durch. Dabei spiegelt der TOC-Wert sowohl organische Verunreinigung des Vorprodukts als auch verbleibende Reinigungsmittel wider. Bei der direkten Swab-Methode werden kohlenstofffreie Swabs im Feststoffmodul des TOC-Analysators (s. Abbildung 1) bestimmt.

Der modulare Aufbau der Shimadzu TOC-V-Serie ermöglicht nun die zusätzliche Bestimmung der Swabs mit dem gleichen Gerät. Hierzu wird ein Feststoffmodul (SSM-5000A) an das Hauptgerät angeschlossen. Dabei spielt es keine Rolle, ob es sich um das Verbrennungs- oder das nass-chemische Modell der TOC-V-Serie handelt. Zur TC-Bestimmung wird die Probe (in diesem Fall der komplette Swab) in ein Keramik-Schiffchen gelegt und in den Ofen geschoben, der auf 900 bis 980 °C geheizt wird. Dort werden alle Kohlenstoffverbindungen zu Kohlendioxid oxidiert. Um eine vollständige Oxidation zu gewährleisten, befindet sich zusätzlich ein Katalysator in der Verbrennungsröhre.

Das entstandene Kohlendioxid wird nun zum Detektor des Hauptgeräts transportiert. Im NDIR-Detektor der TOC-V-Serie befindet sich eine Tandemzelle, die aus einer langen Zelle und einer kurzen besteht. Standardmäßig wird die lange Zelle für die Wasseranalytik und die kurze für Feststoffanalytik verwendet. Somit kann das System nun problemlos in der Reinigungsvalidierung eingesetzt werden, unter voller Beibehaltung der Flexibilität, des Wechsels zwischen Wasser- und Feststoffanalytik.

Probenvorbereitung für die Swab-Bestimmung

Da es sich bei der TOC-Analytik um einen Summenparameter handelt, ist es wichtig zu gewährleisten, dass der gemessene Kohlenstoff wirklich von der beprobten Oberfläche kommt. Deshalb muss das Swab-Material absolut frei von Kohlenstoff sein. Prinzipiell sind verschiedene Swab-Formen bzw. Geometrien möglich. Das hängt von der individuellen Handhabung und Aufgabenstellung ab. Abbildung 2 zeigt zwei Beispiele, einen Filter und ein Wattebällchen aus Quarzfasern: Die Swabs werden zuvor bei etwa 700 °C im Muffelofen ausgeglüht und unmittelbar vor dem Wischen mit Reinstwasser angefeuchtet. In der Praxis sind die Quarzwattebällchen deutlich einfacher zu handhaben. Sie reißen nicht und lassen sich leicht mit einer Pinzette (ausgeglüht) führen und ins Schiffchen übertragen. Die SSM-Kalibration erfolgt bei den hier typischen geringen TOC-Werten mittels verdünnter Glucoselösung für den Bereich 10 bis 100 µg Kohlenstoff absolut (s. Abb. 3). Zur Kalibration wird nur ein Schiffchen mit Keramikwattefüllung verwendet. Zwecks Reinigung wird es einmal vorab im SSM-Ofen bei 900 °C ausgeheizt. Die Glucoselösung kann nun Stufe für Stufe in das Schiffchen eingebracht werden, wobei es in der SSM-Schleuse verbleibt. Für die Proben gilt im Prinzip die gleiche Prozedur. Das Schiffchen bleibt in der Schleuse und die Swabs werden jeweils an Ort und Stelle platziert.

Swab-Methode zum Nachweis von E.coli-Zellen

Das folgende Beispiel basiert auf mit E.coli kontaminierten Stahloberflächen, Petrischalen aus Stahl. Sie dienen als Testflächen für eine gezielte quantitative Verunreinigung mit E.coli-Zellen. Hierzu werden drei Stahlschalen mit E.coli-Suspension verunreinigt. Eine weitere Schale wird zur Ermittlung des Blindwerts lediglich mit Reinstwasser behandelt. Das Wischen der Stahloberflächen erfolgt mit ausgeglühten (über 30 Minuten bei 700 °C) Quarzwattebällchen nach Anfeuchten mit 200 µl Reinstwasser. Zur Kontrolle der Wiederfindung werden genau definierte Mengen von der E.coli-Suspension sowie eine Blindprobe (Reinstwasser) direkt auf die Wattebäusche aufgetragen und gemessen. Die so erstellten Wischproben werden nun im Feststoffmodul SSM-5000A in einer Sauerstoffumgebung bei 900 °C mit einem Katalysator verbrannt. Die Quantifizierung des Verbrennungsprodukts Kohlendioxid ermöglicht schließlich die Bestimmung des TOC (Total Organic Carbon).

Fazit: Die Resultate der Wisch- sowie der Kontrollproben sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Die visualisierte Darstellung in Abbildung 5 zeigt deutlich, dass die Kontaminationen mit dem Wischtest quantitativ erfasst werden. Die Steigungen der Geraden sind praktisch identisch. Als Ursache für die parallele Verschiebung kann ein Blindwert infolge der Wischprozedur angenommen werden. Dieser Blindwert beträgt in diesem Fall rein rechnerisch 9 µg Kohlenstoff absolut. Somit kann abschließend festgestellt werden, dass die TOC-Analyse des Swab-Tests als aussagekräftige Bestimmungsmethode eingesetzt werden kann.

Hintergrund: Charakterisierung der Swab-Test-Methode

  • Wässrige Proben lassen sich schnell und einfach mit der TOC-Analytik bestimmen.
  • Die direkte Swab-Methode misst kohlenstofffreie Swabs im Feststoffmodul des TOC-Analysators.
  • Die modulare Shimadzu TOC-V-Serie ermöglicht, den Swab mit dem gleichen Gerät zu bestimmen.
  • Eine Tandemzelle erlaubt den Wechsel zwischen Wasser- und Feststoffanalytik.

*B. Gierszewski und U. Servos, Shimadzu Europa GmbH, 47269 Duisburg

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