Schnelle Analyse und hoher Probendurchsatz für die Dopinganalyse

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Bei ihrer Methodenentwicklung unberücksichtigt geblieben seien wenige anabole Substanzen wie Tetrahydrogestrinon, Methyltrienolon oder Stanozolol, für die sich die GC/MS als nicht geeignet herausgestellt habe. Sie erfasse jedoch einen oder mehrere Metaboliten verbotener Betäubungsmittel, die am häufigsten verwendeten β2-Agonisten, Hormon-Antagonisten und -modulatoren sowie Beta-Blocker. Nachweisen ließen sich eine große Zahl Aufputschmittel und Substanzen aus allen anderen Gruppen verbotener Substanzen – mit Ausnahme von Peptidhormonen und Glucocorticosteroiden.

Eine der Hauptschwierigkeiten, mit denen Dopingkontrolllaboratorien zu kämpfen hätten, sei die: in einer nur begrenzt vorhandenen, geringen Menge stark matrixbelasteter Probe, vorwiegend Urin, sehr niedrige Gehalte eines weiten Bereichs unterschiedlicher verbotener Substanzen nachzuweisen.

Das Volumen, das derzeit an Laboratorien geliefert würde, betrage 60 mL, berichten Eenoo et al. Diese Probenmenge müsse genügen: für das Screening verbotener Substanzen sowie für eine vollkommen unabhängige Analyse, sofern der erste Test einen positiven Befund ergeben habe. Ziel ihrer Arbeit sei es gewesen, schreiben die Wissenschaftler, die für die Dopinganalyse benötigte Probenmenge so weit wie möglich zu reduzieren. Die von Ihnen entwickelte Screening-Methode erfordere lediglich 1 mL Urin; üblicherweise würde gemäß Literatur ein um das zwei- bis fünffach größere Probenvolumen benötigt. Als weiteres Ziel wurde ein höherer Probendurchsatz pro Zeiteinheit formuliert, um auch den Anforderungen an das Berichtswesen, etwa den von Olympischen Spielen, zu genügen, wonach Analysenergebnisse innerhalb eines Tages beziehungsweise von zwei Tagen vorzuliegen haben.

Technisch und analytisch interessante Details

Im Zuge ihrer Methodenentwicklung und -validierung verwendeten Eenoo et al. dotierte Urinproben von Freiwilligen, denen zuvor eine therapeutische Dosis der Aufputschmittel Prolintan (Catovit) und Sibutramin (Reductil) unter kontrollierten Bedingungen oral appliziert wurde. Einem Milliliter Urin hinzugefügt wurden: 50 µL einer Mischung verschiedener interner Standardsubstanzen, um die verschiedenen Analysenschritte wie Hydrolyse, Extraktion und Derivatisierung statistisch abzusichern, 1 mL Phosphatpuffer (pH = 7,0) und 50 µL β-Glucuronidase. Die Proben wurden bei 56 °C für die Dauer von 1,5 h inkubiert und die hydrolysierten Proben wurden mit 1 mL NaHCO₃/K₂CO₃-Lösung (pH = 9,5) sowie 5 mL Diethylether versetzt. Die Mischung wurde 20 min lang extrahiert und die organische Phase sodann bei Raumtemperatur unter Stickstoff bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 20 µL Acetonitril aufgenommen und mit 100 µL Derivatisierungsreagenz (MSTFA/Ethanthiol/NH₄I im Verhältnis 500:4:2) versetzt. Die Derivatisierung wurde für die Dauer von einer Stunde bei 80 °C durchgeführt. Unter Einsatz des Gerstel-Multi-Purpose-Samplers (MPS) erfolgte die Aufgabe von 5 µL Probenextrakt in den PTV-Injektor des GC; dies sei, versichern die Wissenschaftler, wesentlich mehr als bei früheren Methoden, bei denen mit Split-/Splitlosinjektion gearbeitet würde. Als PTV-Injektor verwendet wurde ein Gerstel-Kalt-Aufgabe-System (KAS). Die Injektion der Probe erfolgte in ein 100 °C heißes KAS, anschließend wurde die Temperatur mit 12 °C/s auf 280 °C erhöht. Zur Analyse der Urinproben setzten die Wissenschaftler einen Agilent GC 7890 in Verbindung mit einem Agilent Triple-Quadrupol-MS 7000A ein; die Quantifizierung erfolgte vermittels interner Standards. Der GC war ausgestattet mit einer Kapillarsäule von nur 12,5 m Länge (HP-Ultra 1, 12,5 m x 0,2 mm x 0,11 µm), was zu einer erheblich kürzeren Analysendauer führte, ohne wesentliche Einbußen in der Signalauflösung. Die Anfangstemperatur des GC-Ofens betrug 100 °C (0,2 min) und wurde dann mit 90 °C/min auf 185 °C erhöht; dann mit 9 °C/min auf 230 °C und weiter mit 90 °C/min auf 310 °C (0,95 min). Die Transferleitung wurde auf 310 °C gehalten.

„Unter Verwendung von Wasserstoff als Trägergas (Flussrate 1 mL/min) und einer kurzen Kapillarsäule ließen sich alle Dopingmittel in einem einzigen Lauf innerhalb von weniger als 8 min detektieren“, berichten Eenoo und Kollegen. Zum Vergleich: Die meisten Screening-Methoden für die Detektion anaboler Steroide besäßen eine Laufzeit von 20 bis 25 min. Das Arbeiten mit einem breiten Bereich von internen Standards ermöglichte eine Evaluierung der Leistungsfähigkeit der Probenvorbereitung. Sechs-Punkt-Kalibrationskurven wurden erstellt durch Dotieren von „Steroid-gestrippten“ Urinproben (drei Wiederholungen je Konzentration). Genauigkeit und Präzision (Wiederholbarkeit) der Methode wurden anschließend für jedes Level geprüft (n = 6) und von Eenoo et al. für akzeptabel befunden.

Bezüglich der qualitativen Analyse erfolgte die Methodenvalidierung gemäß den Eurachem-Richtlinien mit zehn verschiedenen, zufällig ausgewählten Urinproben. Zur Bestimmung der Detektionslimits (LOD) wurden zehn verschiedene Urinproben mit Referenzmischungen unterschiedlicher Gehalte mit Konzentrationen vom 0,05-, 0,1-, 0,2-, 0,5-, 1- und 2-fachen des MRPL-Gehalts dotiert. Das LOD wurde definiert als die niedrigste Konzentration, bei der eine Substanz in allen analysierten Proben detektiert werden konnte (n = 10). Die Wiederholbarkeit wurde durch die Analyse von Mehrfachproben bewertet, die bei unterschiedlichen Gehalten während der Bestimmung der LOD dotiert worden waren. Selektivität und Spezifität wurden mittels Analyse von Blank-Urinproben getestet.

Ihre Methode zeige, schreiben die Wissenschaftler im Journal of Chromatography A, dass die Kombination der Triple-Quadrupol-MS-Technik in Verbindung mit einer Large-Volume-Injektion (LVI) die Detektionsmöglichkeit für die Zielsubstanzen in komplexen Matrices wie Körperflüssigkeiten in erheblichem Maße verbessere.

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