Automatisierte Gelelektrophorese Vollautomatisierte Technik ersetzt Gelelektrophorese

Nukleinsäuretrennung mittels Gelelektrophorese ist relativ aufwändig und setzt den Anwender toxischen Chemikalien aus. Eine neue Automationslösung soll diese Schwachstellen nun beseitigen.

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Nukleinsäuretrennung kommt häufig als analytische Methode für die Qualitätskontrolle von DNA- und RNA-Proben, zur Größenbestimmung von PCR-Fragmenten oder für die Genotypisierung z.B. von Mikroorganismen, Pflanzen oder Tieren zum Einsatz. Die dabei am häufigsten verwendete Methode ist die Gelelektrophorese. Sie erfordert einen relativ hohen manuellen und zeitlichen Aufwand, da die Gele meist selbst gegossen werden müssen. Da Chemikalien wie Ethidiumbromid zum Einsatz kommen, setzen sich die Anwender zudem einem potenziellen Gesundheitsrisiko aus. Abhängig vom Versuchsaufbau hat die Methode noch weitere Nachteile: Die Trennungszeiten der Nukleinsäurefragmente sind lang und es sind relativ große Probenvolumina nötig. Um die Nukleinsäuretrennung zu erleichtern, wurden in den letzten Jahren Systeme, die Fertiggele oder die Lab-on-a-Chip-Technologie einsetzen, entwickelt.

Fertiggel-Systeme

So sind mittlerweile eine Vielzahl verschiedener Fertiggel-Typen für unterschiedliche Durchsatz- und Trennungsanforderungen erhältlich. Neben der Tatsache, dass auch hier noch einige manuelle Schritte erforderlich sind, liegt ein wesentlicher Nachteil der Fertiggele in ihrer eingeschränkten Sensitivität. Insbesondere bei der Trennung von Nukleinsäurefragmenten, die sich in ihrer Länge nur um wenige Basenpaare unterscheiden, ist das kritisch.

Lab-on-a-Chip-Technologie

Bei der Lab-on-a-Chip-Technologie werden die Proben in Mikrokanäle eingebracht, in denen sämtliche Schritte der Nukleinsäuretrennung bis zur Detektion vollzogen werden. Dadurch können Analysen oft schneller, einfacher, sensitiver und mit geringeren Probenmengen durchgeführt werden. In Kombination mit einer automatischen Software für die Datenanalyse weist diese Technologie eine Vielzahl von Vorteilen gegenüber der konventionellen manuellen Gelelektrophorese auf. Doch auch bei dieser Methode muss der Chip weiterhin manuell aufbereitet und mit den Proben beladen werden. Mit gängigen Systemen lassen sich bis zu zwölf Proben pro Arbeitsgang analysieren. Die Prozessdauer beträgt dabei bis zu 40 Minuten. Damit eignen sich diese Systeme nur bedingt für Labore, die höhere Durchsatzraten bewältigen müssen.

Das Qiaxcel-System

Eine neue Automationslösung von Qiagen minimiert die manuelle Handhabung der Gelelektrophorese nun auf wenige Schritte. Das QIAxcel-System (s. Abb. 2) erlaubt die vollautomatische Auftrennung von DNA- bzw. RNA-Fragmenten mithilfe gebrauchsfertiger Gelkartuschen. Zwölf Proben lassen sich so in weniger als zehn Minuten analysieren. Bis zu 96 Proben können ohne manuelle Interaktion analysiert werden. Die gebrauchsfertigen Gelkartuschen (s. Abb. 1) enthalten zwölf Mikro-Kanäle, die mit einer Gelmatrix vorgefüllt sind.

Das System lässt sich mit wenigen, einfachen Schritten bedienen:

• Einsetzen der Gelpatronen;
• Einfüllen der erforderlichen Puffer;
• Einsetzen der Proben, z.B. in einer 96-Well-Platte oder in PCR-Röhrchen;
• Auswahl des Analyse-Programms.

Eine mitgelieferte Software ermöglicht die standardisierte Datenerfassung und -analyse. Die Daten können entweder in einem Elektropherogramm und/oder in einer Gelbild-Ansicht (s. Abb. 3) dargestellt werden. Basierend auf DNA-Längenstandards lassen sich die Fragmentgrößen unbekannter Proben mit nur wenigen Mausklicks ermitteln und werden neben anderen Eigenschaften der detektierten Signale in einem Tabellenformat angezeigt. Diese Informationen können, wie auch die bildlichen Darstellungen, in Daten-Berichten zusammengestellt und direkt ausgedruckt oder für die elektronische Dokumentation exportiert werden.

Breite Anwendungsmöglichkeit

Dank vorprogrammierter Methoden kombiniert mit vorgefertigten Gelkartuschen lässt sich eine große Bandbreite an Proben analysieren. So wird die Trennung und Analyse von

PCR-Fragmenten,

• DNA, die mit Restriktionsenzymen behandelt worden ist,
• synthetischen Oligonukleotiden
• sowie total und complementary RNA ermöglicht.

Aufgrund der hohen Detektions-Sensitivität sind reproduzierbare Ergebnisse auch mit niedrigen Nukleinsäurekonzentrationen möglich. Für Abbildung 4 wurden mit dem Multiplex-PCR-Kit unter Verwendung des Standardprotokolls PCR-Produkte verschiedener aus Blutkarten isolierter humaner gDNA hergestellt. Um die klassische Gelelektrophorese mit dem Qiaxcel-System zu vergleichen, wurden die PCR-Proben (13 μl) anschließend in einem zweiprozentigen Agarose-Gel (A) bzw. unter Verwendung des Qiaxcel-Systems mit der Qiaxcel DNA-High-Resolution-Gelpatrone und der vorinstallierten OM-500-Methode analysiert (B: Gelbild-Ansicht und C: Elektropherogramm). Die Gelbild-Ansicht der Analyse, die mit dem Qiaxcel durchgeführt wurde (B), weist eine höhere Auflösung als die Standard-Elektrophorese auf (A). Jede Probenspur kann als Elektropherogramm visualisiert werden. In Abbildung 4 ist die Spur 7 zu sehen (C).

Fazit

Mit einer Auflösung von drei bis fünf Basenpaaren für Fragmente die kleiner als 500 Basenpaare sind, gewährleistet das neue System eine höhere Genauigkeit und damit bessere Sicherheit bei der Dateninterpretation als die konventionelle Gel-elektrophorese. Als Alternative zur Agarose-Gelelektrophorese reduziert das Qiaxcel-System die Analysenzeit um bis zu 90 Prozent bei gleichzeitig hoher Sensitivität und Auflösung.

*Dr. C. Schade, Qiagen GmbH, 40724 Hilden

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