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Nitrofuran Verbesserte Evaporation zum Nachweis von Nitrofuran-Rückständen

| Autor / Redakteur: Anton Kaufmann, Kathryn Maden und Stephan Walker* / Dr. Ilka Ottleben

Nitrofuran-Antibiotika sind aufgrund ihrer potenziell krebserregenden Wirkung in der EU verboten – Nahrungsmittel unterliegen einer strengen Kontrolle. Eine geeignete Probenvorbereitung hilft, Effizienz und Genauigkeit der Analysen zu steigern.

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(Bild: KLZH)

Wegen des Verdachts auf eine kanzerogene Wirkung ihrer Rückstände wurde in der europäischen Union 1995 die Verwendung von Nitrofuran-Antibiotika verboten. Ein 2002/2003 durch die EU eingeführtes, strenges Kontrollsystem schreibt vor, Nahrungsmittel (im wesentlichen Fleisch, Fisch und Schalentiere) mittels hochsensitiver Methoden auf diese Antibiotika-Klasse hin zu untersuchen. Das durch die EU-Vorschrift festgelegte Minimum Required Performance Limit (MRPL) beträgt 1 µg pro Kilogramm essbarem Gewebe und gilt für alle Produkte die entweder lokal produziert oder in die EU eingeführt werden.

Viele Publikationen beschreiben Methoden und identifizieren Metabolite sowie Derivate der betroffenen Arzneimittel [1]. Zur Vermeidung von Matrix-Effekten erfordert die analytische Methode eine sehr gute Probenvorbereitung und kann besonders im Hinblick auf die Evaporation sehr arbeitsintensiv und zeitaufwändig sein. Nachfolgend wird beschrieben, welche Verfahrensvorteile einschließlich der Verbesserungen im Arbeitsablauf durch die Optimierung der Probenvorbereitungs-Methodik im Kantonalen Labor Zürich (KLZH) erreicht wurden.

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Die Probenvorbereitung für die Nitrofuran-Analyse

Von den vielen in der Literatur zitierten Methoden zur Probenvorbereitung wird der physikalisch-chemische Assay mit chromatographischer Separation und massenspektroskopischer Detektion (MS) der Metaboliten von vielen Laboratorien bevorzugt. Das generelle Schema zur Vorbereitung und Analyse von Nitrofuranen in Nahrungsmitteln im KLZH ist (s. Abb. 1) wie folgt:

  • Homogenisierung der Gewebeproben;
  • Säurehydrolyse zur Freisetzung der gewebegebundenen Metaboliten;
  • Derivatisierung der Metabolite mit ortho-Nitrobenzaldehyd zur Steigerung der Molmasse und Erhöhung der Detektions- Empfindlichkeit;
  • Anschließende Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat;
  • Evaporation bis zur Trocknung;
  • Resuspension mit Wasser;
  • Aufreinigung der Proben über Solid Phase Extraktion (SPE) zur Entfernung interferrierender Matrix-Elemente, beispielsweise Lipide;
  • Eluierung mit ammoniakalischem Methanol;
  • Evaporation bis zur Trocknung;
  • Resuspension mit definiertem, geringen Lösungsmittelvolumen passend zur Chromatographie;
  • Separation durch Ultra High Performance Liquid Chromatographie (UHPLC) und Analyse durch MS/MS.

Sehr zeitaufwändig und arbeitsintensiv sind in dieser Methode die Extraktion und die beiden Evaporationsvorgänge bis zur Trocknung.

Am KLZH wurde die Evaporation innerhalb der Probenvorbereitung traditionell mit Rotationsverdampfern durchgeführt, wobei sich die Methode der Nitrofuran-Testung durch gute Wiederfindungsraten als zuverlässig erwiesen hat. Trotzdem zeigt sich eine Reihe von Nachteilen. Ein wesentlicher ist, dass es sich bei Rotationsverdampfern um „Einzelproben“-Systeme handelt – so muss der Prozess kontinuierlich überwacht werden, um z.B. ein „Aufschäumen“ oder einen „Siedeverzug“ zu vermeiden.

Für Nitrofuran-Kontrollen werden im KLZH typischerweise Serien von 5 bis 30 Proben angeliefert. Kürzere Serien können mit einem Rotationsverdampfer noch in einem absehbaren Zeitrahmen bearbeitet werden – bei größeren Probenmengen wird jedoch schnell die Kapazitätsgrenze erreicht.

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