Wie basisch darf es sein?

In breitem pH-Bereich einsetzbar Wie basisch darf es sein?

17.10.2016Autor / Redakteur: Fredrik Limé, Robert Fredriksson, Harald Dibowski & Cecilia Mazza* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus |

Hohe pH-Werte gehen häufig zu Lasten der Säulen-Performance. Gerade für die Biochromatographie sind dies keine guten Voraussetzungen. Ein neues Material erlaubt den Einsatz in einem größeren pH-Bereich – bei gleichbleibender Leistung.

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Abb.1: Trennung von Angiotensin I, II, und III mit einer 50 x 2.1 mm Kromasil EternityXT 1,8-C18 Säule [Bedingungen (niedriger pH, oben): mobile Phase A 0,1% TFA in Wasser (pH 1,9), mobile Phase B 0,1% TFA in Acetonitril, Gradient 0 min 9% B, 10 min 36% B, Flussrate 0,7 mL/min, Detektion UV @ 220 nm; Bedingungen (hoher pH, unten): mobile Phase A 0,1% Ammoniumhydroxid in Wasser (pH 11,0), mobile Phase B Acetonitril, Gradient 0 min 5% B, 10 min 40% B, Flussrate 0,7 mL/min, Detektion UV @ 225 nm.]
(Bild: Akzo Nobel)

Umkehrphase-(RP/Reversed Phase) UHPLC und HPLC sind die am häufigsten verwendeten Screening-Technologien in Entwicklungslaboren und in der Qualitätskontrolle. Traditionell sind daher die meisten auf Silika basierenden Materialien die populärsten Medien für UHPLC/HPLC, obwohl diese in der Regel nur in einem pH-Bereich von 2 bis 8 verwendbar sind. Die Nutzung außerhalb dieser Grenzen führt häufig zu Retentionszeit-Verschiebungen und Verlust der
Performance, was letztlich höhere Verbrauchskosten für den Anwender bedeutet.

Stationäre Phasen, die oberhalb von pH 8 verwendet werden können, zeigen eine erhöhte Flexibilität in Analytik- und Entwicklungslaboren, da diese Materialien eine breitere Auswahl der Puffer und ein größeres pH-Fenster für das Screening von potenziellen Medikamenten und Biopharmazeutika ermöglichen.

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Abb.1: Trennung von Angiotensin I, II, und III mit einer 50 x 2.1 mm Kromasil EternityXT 1,8-C18 Säule [Bedingungen (niedriger pH): mobile Phase A 0,1% TFA in Wasser (pH 1,9), mobile Phase B 0,1% TFA in Acetonitril, Gradient 0 min 9% B, 10 min 36% B, Flussrate 0,7 mL/min, Detektion UV @ 220 nm; Bedingungen (hoher pH): mobile Phase A 0,1% Ammoniumhydroxid in Wasser (pH 11,0), mobile Phase B Acetonitril, Gradient 0 min 5% B, 10 min 40% B, Flussrate 0,7 mL/min, Detektion UV @ 225 nm.]

Abb.2: Änderung der Selektivität auf einer 50 x 2,1 mm Kromasil EternityXT 2,5-C18 mit 20 mM Natriumphosphat bei pH 2,1, 7,2 und 11,3 (Bedingungen: mobile Phase A 20 mM Natriumphosphat, mobile Phase B Acetonitril, Gradient 0 - 0,5 min 10% B, 5,5 min 50% B, Flussrate 1,5 mL/min, Detektion UV @ 254 nm).

Abb.3: Vergleich von regulären C18 und mechanisch/chemisch stabilen Kromasil Eternity XT C18 Silica Verlust bei Verwendung von „Cleaning in Place“-Bedingungen (CIP) verschiedener NaOH-Konzentrationen in Ethanol (50/50)

Abb.4: Langzeitstabilität Kromasil Eternity XT pH 10,5

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Die pharmazeutische Industrie und Produzenten von Peptiden oder Oligonukleotiden APIs, die in der Regel mit komplexen Probengemischen arbeiten müssen, benötigen stationäre Phasen mit möglichst hoher mechanischer Stabilität und chemischer Beständigkeit unter höheren pH-Werten als mit klassischen Silikamaterialien.

Beispiel: Peptid-Trennung

Die hier beschriebenen UHPLC/HPLC-Phasen bieten daher eine Plattform, die sowohl die hohe chemische und mechanische Stabilität besitzen, um zum Beispiel die Elution unter basischen Bedingungen als auch Verwendung von hoher Konzentration NaOH zur Elution von schwierigen Analyten und Verunreinigungen durchzuführen, was für Synthesechemiker und Biochromatographie-Anwender wichtig sein kann.

Eine schnelle Screening-Methode für Peptide ist zum Beispiel ein kritischer Faktor für die biotechnologische Industrie. In Abildung 1 erkennt man den Vorteil durch Nutzung sowohl saurer als auch basischer pH-Werte zur Erweiterung der Selektivität und Auflösung für analytische Anwendungen und daraus resultierend eine effektive Aufskalierung in präparativen Methoden. Die in dieser Studie verwendete Mischung enthält drei Peptide, aber unter sauren Pufferkonditionen erfolgt eine Koelution zwei dieser Peptide bei pH=1,9. Durch Erhöhung des pH-Wertes in der mobilen Phase auf pH=11 kann eine vollständige Auftrennung aller drei Substanzen erreicht werden. Wie ebenfalls in Abbildung 1 zu erkennen, erfolgt eine Änderung der Selektivität/Elutionsreihenfolge zwischen Angiotensin I und III. Dieses Ergebnis zeigt, dass man gezielt die Änderung des pH-Wertes zur Methodenoptimierung einsetzen kann:

Angiotensin I Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu,

Angiotensin II Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe und

Angiotensin III Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe.

Abbildung 2 zeigt ein weiteres Beispiel zur Änderung der Selektivität aufgrund gezielter pH-Änderungen. Durch die Trennung eines Gemisches mit neutralen (Fenuron), sauren (Nitrobenzoesäure, pKa 3,7) und basischen Analyten (Procain, pKa 9,0) kann der Anwender pH-gesteuert die Retentionszeit und Selektivität beeinflussen. Basische Moleküle liegen in der ionisierten Form vor, sofern der pH-Wert der mobilen Phase unterhalb des pKa-Wertes ist. Daher eluieren Basen häufig mit sehr kurzen Retentionszeiten bei sauren pH-Werten in der RP-Chromatographie. Andererseits können Basen bei hohen pH-Werten neutralisiert werden (in der Regel zwei Einheiten höher als der pKa-Wert) und damit eine lange Retentionszeit aufweisen.

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In breitem pH-Bereich einsetzbar Wie basisch darf es sein?

Beispiel: Peptid-Trennung